癌症中自主和非自主复制的存在及其通过炎症的联系：来自一个肺癌病例的发现

宗康拉* 张辉 张旭 赵进明

【以下为译文，英文版原文参考：The Presence of Autonomous and Non-Autonomous Replication in Cancer and their Co.pdf】

摘要

尽管小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向治疗广泛应用于癌症临床，这些抑制剂作用机制的某些问题仍不清楚。例如，药物靶向的细胞在肿瘤中甚至不占多数时，它们是如何完全控制肿瘤较长时间 (一年以上) 的？这里我们报告对一个肺癌病例的观察，并为这个长期未决的临床难题提供解释。我们的分析表明，在许多类似的病例中，癌症由两种肿瘤细胞组成，一种能够通过已知突变进行自主(或自我驱动)复制，另一种复制依赖于炎症。两者通过自主复制的肿瘤细胞引起的炎症联系。TKI抑制自主复制的细胞消除了炎症，从而控制非自主复制的肿瘤细胞。

引言

过去十年中，小分子靶向治疗如针对EGFR的TKI(酪氨酸激酶抑制剂)对特定的肺癌病人取得了较高的应答率和显著的临床疗效。病人筛选的可靠标准是存在EGFR基因的特定突变，例如肺癌患者的外显子19、20或21突变。在这些患者中，经常观察到TKI治疗甚至对晚期癌症也非常有效，患者临床症状快速缓解，疾病长期稳定控制，通常持续数月甚至数年。人们一直认为这种显著的疾病控制背后的机制是通过每天给予小分子抑制剂，酪氨酸激酶分子的激酶功能被完全抑制，从而肿瘤不能复制，被抑制肿瘤细胞凋亡。这个机制假设肿瘤中的所有肿瘤细胞包含能被靶向的突变，否则如何抑制不能被靶向的肿瘤细胞？然而在几乎所有的病例中实际测量的突变频率非常低，通常小于40%。那么问题出现了:为什么其它的非突变细胞在药物存在时不复制？这个问题没有得到令人满意的解决，尽管它明显存在于许多TKI治疗的癌症病例中。在此我们报告对一例肺癌患者的观察和治疗过程。该病人有28%EGFR基因突变，连续TKI治疗两年，疾病控制稳定，短暂停药13天后，肿瘤复发快速反弹，伴随临床症状，恢复TKI治疗后，肿瘤应答且症状得到控制。这些观察支持这一解释:在已建立的肿瘤中，有两种肿瘤细胞复制，一种是自主复制，通过特定突变使细胞癌变(该病例中为EGFR)，另一种是非自主复制，依赖前者通过炎症诱导。控制整个肿瘤的进展取决于这两类肿瘤细胞间的关系。靶向治疗仅在能抑制大部分或全部自主复制细胞的复制时才有效。由于新的耐药突变只在肿瘤细胞复制过程中发生，因此减少自主驱动肿瘤细胞的复制，从而抑制依赖的非自主复制成为所有靶向治疗的最高目标。本病例的教训强调在所有癌症病例中鉴定这两种肿瘤细胞的存在和它们之间关系的重要性，有助于制定更好的癌症管理策略。

病例描述

2016年，一中年男子出现持续疲劳和咳嗽，偶有血痰。医学检查发现右肺中段有一个2.5cm(最大直径)的肿块。右肺结节活检证实为腺癌。PET-CT进一步检查显示原发性肿瘤代谢中度活跃(图1)双肺多发小结节，无明显代谢活动(图1)、左锁骨上淋巴结转移(最大的一个测得直径为1.6CM)和左肋骨骨转移(表1)。

图1：PET-CT显示的确诊时具有代谢活性的原发灶(SUV=5.3)

一组常见肺癌肿瘤标记物的测试显示CEA和Cyfra21-1轻微增加(表1)。该病例被视为IV期，由于缺乏适合靶向治疗的突变，因此接受了化疗。根据NCCN指南对该癌症的建议，使用培美曲塞和铂进行了6轮化疗。最初显示了轻微的应答，但肿瘤大小和肿瘤标志物随后随着肿瘤进展而反弹(表1)。该患者还出现了身体状况恶化，似乎不可能继续化疗。然后再次对肿瘤进行活检，并检测可能适合TKI靶向治疗的突变。在EGFR基因中发现了丰度为28%的T790M突变，患者接受了奥希替尼治疗(80毫克/天)。反应很快。几天之内，患者的身体状况有了明显改善。在TKI治疗的一个月内，敏感的肿瘤标记物都显著下降(表1)。从第8个月到第17个月，患者处于稳定状态，没有疾病进展。使用奥希替尼一年后，PET-CT成像显示锁骨上淋巴结转移消失，原发病灶无明显缩小(表1)。就在这个时候，患者来到我们这里寻求关于如何实现进一步应答或长期生存的建议。由于在持续治疗的情况下没有观察到进一步的应答（肿瘤减少或根除),而奥希替尼的副作用也是一个需要处理的问题，这表明可能没有必要继续每日给药奥希替尼，而目前对疾病的控制也可能是最初由TKI治疗激活的抗肿瘤免疫的作用。这不是不可能的，因为在我们的临床研究中，我们已经看到了许多通过初始TKI疗法激活抗肿瘤免疫的病例(我们未发表的结果)。检查这种可能性的一种方法是观察最初的活检组织，寻找免疫反应的迹象。然而，由于需要进行基因分析，最初和第二次活检样本都被用于该目的，因此没有样本可供我们直接检查这种可能性。此外，考虑到基因测试仅显示28%的突变频率，长期使用奥希替尼和稳定但相当迟钝的肿瘤消退表明所有靶细胞都被耗尽。那么，剩下的肿瘤细胞是什么，为什么在奥西默替尼的作用下没有进展？一个线索来自最初活检样本的基因测试，结果显示任何常见的肺癌突变都呈阴性。这就是患者最初接受化疗而不是TKI疗法的原因。这一系列证据表明，EGFR突变可能不是这个肿瘤发生的最初原因，而是在最初六轮化疗期间肿瘤的逐步生长过程中发生的。这种发展的可能机制将在后面的讨论部分讨论。有了这个想法，我们假设这种情况下的长期连续TKI治疗可能已经根除了所有的EGFR突变细胞，剩下的细胞对TKI没有应答。由于这些细胞是依赖于宿主信号进行复制的原始肿瘤细胞，在没有该信号和其他刺激(如化疗)的情况下，这些细胞可能保持休眠，从而在TKI治疗后显示出疾病的长期和稳定性质。在这种情况下，确认这种可能性对于后续治疗策略的设计是至关重要的，因为TKI完全失活的话我们就要停止不必要的治疗，同时切除残余休眠肿瘤的手术在长远意义上将防止肿瘤进一步突变而产生新的自主复制。为此，我们建议停止奥希替尼，看看是否支持上述假设。但令人惊讶的是，在停用奥希替尼后3-4天，患者出现了逐渐加重的不适。停药后一周，出现了严重的症状，包括胸闷和疼痛、持续咳嗽和低热。我们不得不暂停TKI停药试验，并在停药后13天恢复治疗。TKI治疗恢复时的肿瘤标记物测试显示所有敏感标记物的明显反弹(表1 ),表明快速和活跃的肿瘤增殖和进展。

表1：治疗和应答

恢复奥希替尼几天后,症状逐渐消退,服药三周后肿瘤标志物回到正常范围。TKI停药后的症状和肿瘤短暂恢复进展清楚地表明,尽管服用奥希替尼肿瘤稳定，病人临床缓解超过2年,但并不是所有药物可靶向的突变肿瘤细胞都已通过治疗被消除。TKI停药时,肿瘤恢复活跃的自主复制，肺癌的典型症状再次出现。恢复治疗可以重新控制肿瘤复发。这个短暂的过程证明自主复制的突变肿瘤细胞一直存在,但被TKI治疗抑制，也预演了最终耐药发生时的情形。在缺少其他有效控制肿瘤复制手段来阻止新转移灶建立的情况下，维持长期疾病控制的唯一机会可能是减少这种耐药情况发生的机会。大幅降低现存的肿瘤负荷,即正在复制的肿瘤细胞池的大小会直接影响这个可能。因为新转移灶的建立是要靠单个扩散的自主复制的肿瘤细胞,如果最初转移灶的自主复制被TKI有效地抑制，这个转移灶很少有机会形成能自主复制的第二突变。最可能出现耐药突变的地方可能会在已建立的肿瘤结节内,那里数以百万计的肿瘤细胞正等待着在受到刺激导致的复制中出现变异。因此,减少可见的肿瘤负荷将有助于消除任何可能在复制中形成新突变的基础。为此，在PET-CT影像证实没有活跃的转移灶之后(图2),我们手术切除了原发肿瘤。

图2：PET-CT影像显示术前原发灶（SUV=1.7)

术后病理分析显示肿瘤复制活跃。如图3所示,大约10-30%的肿瘤细胞Ki-67染色阳性(图3,Ki-67)。这与先前在短暂的TKI停药期间观察到的活跃的肿瘤反弹一致。为准备手术,术前TKI治疗停药几天,这可能促使肿瘤复制快速反弹。事实上，采用另一复制标志物PCNA(图3中,PCNA)，多数肿瘤细胞的染色阳性显示多数肿瘤细胞正在复制。既然不超过三分之一的肿瘤细胞包含EGFR突变,即自主复制,肿瘤中大部分肿瘤细胞的活跃复制表明多数肿瘤细胞不受EGFR突变驱动。当评估抗肿瘤免疫是否参与时发现,切除的原发肿瘤有少量T细胞(图3中,CD3),表明缺乏抗肿瘤免疫。由于没有抗肿瘤免疫保护，术后易复发，患者术后接受了两轮培美曲塞和铂类化疗，联合奥希替尼(表1)，至今无复发。

图3：术后肿瘤病理切片显示自主复制(Ki-67)和非自主复制(PCNA)以及T细胞(CD3)的存在。显示了HE、CD3、Ki-67的100倍和PCNA的400倍染色切片的显微图像

讨论

这个病例揭示了癌症管理中值得进一步讨论的几个重要方面。第一个问题是，一个只有少数肿瘤细胞带有靶向突变的混合肿瘤细胞群，怎么能被只针对这种突变的药物完全控制呢？这是许多接受TKI治疗，肿瘤和症状控制良好的患者出现的典型情形。我们只能假设在肿瘤的突变和非突变部分之间一定存在依赖关系，即后者的复制依赖于前者。换句话说，在这个病例中，肿瘤有两个部分，一部分自主复制，另一部分非自主复制。基于这一假设，我们可以解释为什么靶向28%肿瘤细胞的奥希替尼能完全控制整个肿瘤超过两年。那么下一个问题是，这个控制是如何传递的？肿瘤反弹与症状复发紧密相关，提示这是通过局部炎症的诱导实现的。突变的肿瘤细胞能够自主复制，同时产生炎症相关的趋化因子，这反过来驱动大部分非突变细胞的复制。之前的研究已经证明，自主复制和依赖NF-κB的炎症以及肿瘤负荷之间的联系[1-3]。这些研究指出，EGFR突变及其下游KRAS突变没有炎症时比有炎症时显著降低肿瘤负荷,这支持我们的假设：有两种由复制驱动机制区分的肿瘤细胞,一种基于突变的自主复制，另一种依赖自主复制肿瘤细胞诱导的炎症进行非自主复制。一个有待回答的问题是，如何在一个特定的肿瘤中区分自主复制和非自主复制。到目前为止，我们的经验表明Ki-67可能是自主复制的标志物，而PCNA则显示自主和非自主肿瘤细胞的复制。鉴别两类肿瘤细胞的存在及它们与炎症的联系对于理解临床上一些令人困惑的观察是至关重要的。例如，药物对某个特定突变的完全控制依赖于该突变是肿瘤中唯一的自主驱动突变，当存在多个自主驱动突变时，任何一种药物的疗效肯定是短暂的。这可以解释在不同情况下TKI疗效的巨大差异。判断靶向治疗是否可能有效的方法是观察不同自主复制肿瘤细胞间的比例和药物所靶向突变的丰度。只有当活跃的自主复制肿瘤细胞数量少于有靶向突变的细胞时，靶向治疗才可能有效(图4A)。否则，由于存在其它不受治疗控制的自主复制，靶向治疗不可能实现对肿瘤复制的完全控制(图4C)。当大多数突变细胞的复制活跃时,即使所有的自主复制细胞可以被单一药物靶向,治疗也不太可能长期有效，因为治疗期间的控制漏洞，可能形成绕过靶向突变的新突变(图4B)。几乎所有靶向治疗病例都会通过非自主复制产生非靶向突变而形成耐药(图4D)。因此，当务之急是找到尽可能延长控制时间的方法。这需要理解下面的问题。

图4：靶向治疗可能有效也可能无效的各种情况

本病例提出的第二个问题是，在许多TKI治疗的病例中，TKI治疗是否通过杀死靶点细胞而起效。多年来，由于靶向治疗确实会导致肿瘤缩小，而这是肿瘤细胞死亡的标志，因此人们自然而然地认为这个假设正确。之前的研究也表明，在动物模型中，靶向治疗后肿瘤细胞迅速死亡[4]。但本例的观察结果与这一假设相矛盾。肿瘤中28%的突变细胞，经过2年治疗，原发肿瘤减小，随后肿瘤生长完全抑制，根据这一假设预测，应该已经杀死了大部分具有自主复制能力的突变细胞。如果这个预测正确，我们预期短暂TKI停药肿瘤应缓慢反弹，因为长期有效的TKI治疗后，只有少数能够反弹的细胞存活。相比之下，我们看到肿瘤复制快速反弹，症状不断恶化，这支持大量细胞的全面复制。在手术肿瘤样本中，约30%的Ki-67阳性细胞也支持在经过长期有效的TKI治疗后，自主复制的肿瘤细胞几乎完全保留。因此，这些观察指出肿瘤控制的机制是“抑制”，而不是“杀死”。靶向治疗缺乏对肿瘤细胞的杀伤，这也许可以解释为什么靶向治疗很少能治愈。因为自主复制的肿瘤细胞没有被药物清除,在这种情况下这种疗法没有完全应答的可能。这个病例,就像在许多其它采取类似治疗的病例一样,原发肿瘤最初缩小，然后保持稳定的负荷，大小没有进一步缩小。如果我们假设没有直接杀伤靶点肿瘤细胞,那么肿瘤负荷的减少可能来自肿瘤的非自主复制部分。这表明当消除驱动非自主复制的因子(由于抑制自主复制诱导的炎症)，许多非自主复制的肿瘤细胞可能死亡。进而引出一个与靶点肿瘤细胞没有被杀伤有关的有趣问题：已扩散的单个潜伏转移灶和可抑制其复制的药物之间的关系。因为每个转移灶的复制不依赖其它的病灶,尤其是原发灶，它比转移灶含有更多细胞,当原发灶形成耐药细胞时，没有理由认为靶向治疗不能继续控制转移灶的复制。换句话说，停止之前有效的靶向治疗是错误的选择。因为这些转移灶没被靶向治疗杀死,而是被抑制。对控制进展而言，继续抑制是必要的有时甚至是至关重要的。然而我们在临床上看到过许多病例，病人在靶向治疗药物耐药时采取错误措施。停药可能导致以前被很好抑制的转移灶爆发性进展。正因为如此，我们的患者在术后不久就接受了靶向治疗，即使随后出现耐药性复发，也将继续靶向治疗。

该病例引起关注的第三个问题是肿瘤进展与症状之间的关系。肿瘤进展与症状强度之间存在密切的相关性。这种紧密的联系，尤其是在TKI治疗后症状快速缓解，在许多靶向治疗的病例中常见。但这种关系在机理上还没有得到很好地解释。通常认为，癌症症状是肿瘤生长的结果，尽管在许多病例中，已确诊的肿瘤负担很大，但几乎没有严重症状。肿瘤负担和症状之间的这种分离已经被主流完全忽视了。从这个病例中可以看出，TKI治疗2年后症状完全抑制，停药几天后症状迅速再现，同时肿瘤复制迅速反弹，支持肿瘤生长与症状之间的紧密联系。但肿瘤生长本身不是症状的直接原因。相反，相关因素是炎症。如前所述，EGFR突变细胞的自主复制产生炎症趋化因子，进而驱动大量非自主复制肿瘤细胞的复制。正是炎症导致了这些症状。当TKI治疗抑制了自主复制时，炎症来源被切断，症状迅速缓解。基于这一解释，我们能用症状作为间接的肿瘤标志物来衡量自主复制的活性，或用症状的缓解来衡量抑制自主复制(从而抑制整个肿瘤的生长)的治疗有效性。事实上，在许多病例中，当症状消退时，病人往往认为病情已得到控制，这种印象往往是正确的。肿瘤诱导的炎症可能是系统性的，临床检查通过验血来测量，常与感染引起的炎症混淆，这是临床上肿瘤患者滥用抗生素的主要原因。同样，基于在患有炎症的癌症患者中存在广泛的抗生素临床滥用，将抗生素指责为检验点治疗失败的罪魁祸首也需要受到质疑。高炎症和高炎症背后对自主复制肿瘤细胞缺乏控制可能是PD-1抗体治疗失败的原因，因为这类治疗在重新控制之前往往会导致暂时的肿瘤进展。在没有暂时进展空间的情况下，控制肿瘤之前可能会发生超进展和加速死亡。因此，正确认识癌症患者中炎症和症状的来源可以带来一些有益的操作，不仅减少肿瘤非自主复制部分的复制动力，而且有助于正确管理炎症和避免癌症患者滥用抗生素。

与这个病例相关的最后一个问题是自主复制肿瘤细胞的起源，许多其他病例也提出了这个问题。这是一个颇有争议的问题，因为传统观点一直认为所有的肿瘤细胞都是自我驱动的。但随着更精确的基因测试和临床应用，这种说法似乎是不正确的，因为许多进行性肿瘤细胞依赖某种宿主因子生长。最好的例子是表达强ER/PR受体的乳腺癌细胞。它们依赖雌性激素生长，因此在癌症手术后用药物抑制这些激素导致长期控制。这个控制如此有效甚至超过许多实体瘤中的免疫控制。在这种情况下，我们也见证了炎症驱动的非自主复制肿瘤细胞的进展，这在肺腺癌中是常见的。目前尚不清楚的是，自我驱动的突变是否可能在非自我驱动的肿瘤复制过程中产生，这一案例部分揭示了这一点。或者它来自一个正常细胞的新突变，把它变成一个癌细胞？这个案例的经验支持前者。在通过活检初步诊断为腺癌时，进行了基因检测，未发现EGFR突变。在六轮化疗(或刺激)和持续的肿瘤进展后，进行了第二次活检，鉴定出T790M突变(28%频率)。随后使用奥希替尼证实了这一发现。如果第一次测试是正确的，这种差异只能通过假设EGFR突变出现在化疗期间来解释。这种突变的起源可能来自不含EGFR突变的生长中的肿瘤细胞。在过去的十年中，我们已经多次观察到一些肉瘤病例中的外伤和一些胰腺癌中的胰腺炎发展为癌症(我们未发表的观察结果)。这些案例表明细胞增殖和癌症发展之间有很强的相关性。考虑到DNA突变只在复制过程中遗传，将自驱动突变的来源放在非自主复制的肿瘤细胞是一种合理的解释。基于这种情况，许多临床现象可以得到解释。例如，TKI疗法中最有可能产生耐药性的原因和来源是在复制过程中产生新突变的非自主复制(图4D)。考虑到这一点，出现了两个直接的预测：1)不受先前TKI疗法控制的新突变将可能偶然来自最大的肿瘤细胞群，因此减少肿瘤负荷将显著减少这种机会，并延长当前TKI疗法的控制；2)即使出现耐药性突变，能够自主复制的扩散肿瘤细胞仍将被目前的TKI疗法抑制，因此尽管有耐药性的证据，以前有效的TKI疗法仍应继续，而不是放弃。正是基于这一点，我们建议了手术，并继续使用奥希替尼，不管该病例随后是否产生耐药性。该病例的后续研究将检验这些预测[5-11]。

结论

虽然这个病例是关于靶向治疗的，但是从这个病例中得到的教训也可以应用到其他治疗中。例如，抗原特异性抗肿瘤免疫可以靶向多种肿瘤成分，这取决于肿瘤各部分的可用抗原。根据本病例的观察结果以及靶向治疗非常有效的许多其他类似病例，可以推断出最有效的抗肿瘤免疫反应应该针对自主复制的部分，而不是炎症依赖性的非自主群体。识别转移肿瘤的免疫能更有效地保护术后复发和避免肿瘤的转移，并且那些肿瘤的转移灶必须能够自我驱动复制。与靶向药治疗相比，免疫通常没有任何副作用，但有效保护的持续时间可能因情况而异，这取决于剩余免疫的强度和质量。另一方面，靶向治疗的保护持续时间取决于自主复制的二次突变发生的可能性，如果药物对含有靶向突变的单个扩散肿瘤细胞高度有效，这种可能性应该非常小。在这方面，靶向治疗在抑制转移方面应该比免疫更可靠，因为它不会像免疫那样衰退。基于这一原理，在通过靶向治疗实现严格的肿瘤控制的情况下，通过各种方式如放射和手术去除所有可见的肿瘤负担，并将防止复发留给靶向治疗应该是明智的选择。对于长期生存来说，转移的存在不是关键，更重要的是是否有控制转移的可靠方法。在许多有效抗肿瘤免疫的病例中，甚至IV期癌症也可以被根除并保持长期无病生存(我们未发表的结果)。

参考

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