非自主性癌症复制在癌症临床治疗中的存在和意义：

来自卵巢癌病例的观察和提示

宗康拉*、张旭、张辉

癌症临床管理研究所，北京，中国

【以下为译文，英文版原文参考：Existence and Significance of Non-Autonomous Cancer Replication for Clinical Man.pdf】

摘要

癌细胞通过复制进步。令肿瘤外科医生和肿瘤学家困惑的不是癌细胞为什么会持续生长，而是为什么其中一些细胞不会像预期的那样稳定生长，并且这种行为在不同病例之间，甚至在同一病例的不同病变之间会有所不同。我们之前的报告已经通过靶向药物（如肺癌中的TK抑制剂）仅靶向肿瘤中的少数细胞，解决了严格控制肿瘤进展的问题。这一情况产生了自主和非自主肿瘤复制的概念，即根据驱动肿瘤复制的分子信号的来源，将癌细胞复制的模式分为两类。这种肿瘤复制模式的建立对癌症的临床管理非常有用，尤其是对几乎所有病例的术后癌症复发风险评估至关重要。在本报告中，我们将这一概念应用于两例卵巢癌病例的分析和管理，以表明肿瘤复制模式是当前TNM分期系统之上癌症分期的一个新维度，有助于个体化病例评估和管理。

介绍

1950年，哈佛医学院的年轻外科医生J. Englebert Dunphy在《新英格兰医学杂志》上发表了一篇论文，描述了4例癌症病例，以说明癌症不是主流所预期的稳定不可逆转的增长性疾病，而是一种行为和结局不可预测的疾病[1]。用他的话来说，需要回答的问题“不是什么使细胞突然生长，而是什么使它们长期处于停滞状态”。随着这个问题的回答，他希望在未来，“有可能确定给定肿瘤的生长曲线，以便在静止期而不是非常活跃的生长期计划摘除”。 Dunphy医生随后警告：“在对任何给定肿瘤的生长潜力做出准确评估之前，外科医生必须继续在相对黑暗的环境中摸索”[2]。自从Dunphy提出癌症难题以来，已经过去了70年，但我们仍然对每个癌症病例的生长倾向知之甚少，无法为该病例选择最佳治疗策略。一方面，我们已经了解了相当多的肿瘤生物学知识，因为当今的基因检测通常可以精确定位许多肿瘤癌变的原因（癌基因和其中复制驱动的突变）。另一方面，即使精确靶向肿瘤复制的药物取得了成功，我们也没有解释我们的知识与临床实际之间的某些差异。例如，在我们最近的报告中，我们讨论了这样的观察结果，即通过靶向治疗药物（如TK抑制剂）进行的最严格的抗肿瘤控制只能作用于肿瘤中的少数肿瘤细胞，因为基因检测已经清楚地表明，并非肿瘤组织中的所有肿瘤细胞都包含靶向突变（称为“突变丰度”）[3]。那么，其他非靶肿瘤细胞是什么？为什么在TKI疗法下它们没有进展？对这种看似矛盾的观察进行探索的结果导致了两种肿瘤复制模式的发现：自主或自我驱动的复制，这就是众所周知的；以及非自主复制，这就是隐藏的。根据定义，非自主复制的概念是说肿瘤的复制不是自驱动的，而是依赖于仅可从宿主获得的生长因子。尽管还有待在实验系统中证实，但我们基于现有证据和临床观察的假设指出，两种肿瘤复制模式之间最可能的联系是通过自主复制的肿瘤细胞趋化产生的局部炎症[3]。当TKI药物抑制自主复制时，对局部炎症的支持终止，肿瘤的非自主复制也终止。这一假设可以解释与使用TKI药物相关的几个未解之谜，如耐药机制和动力学。在大多数肿瘤细胞的非自主复制过程中出现新的突变将是耐药的主要来源，并且一些肿瘤可能一开始就包含一种以上的自驱动突变，因此是“天然耐药的”。关于肿瘤复制模式的这一理论/假设的意义在于，它已远远超出了每种肿瘤的基因组成的复杂和不可理解的细节，精确地进入了它们的实际增殖，并使预后的个体评估成为可能。此外，这种评估的实用特征很容易用于当前的临床实践，因为即使没有基因测试，我们也可以做出准确的评估。在本报告中，我们描述了在两例晚期卵巢癌病例中评估肿瘤复制的应用，以回顾性方式解释过去的临床病史，并指导未来治疗的选择。

我们选择两例卵巢癌病例的原因是多方面的。首先，晚期卵巢癌因大多数病例的预后不良而臭名昭著，但在某些病例（25-30%）中，癌症表现为不进行性，患者预后相对较好（> 5年术后生存），且不知道原因。由于缺乏分子标准，很难对每例病例进行准确分类，大多数病例根据基于TNM的FIGO标准分期[4]。这些病例将提供一个额外的维度来帮助更准确的分期。其次，这些病例的相似性令人惊讶地高，达到所有病例的1/4-1/3，正如我们在有限的卵巢癌病例经验中所计数的那样。因此，它并不罕见，但与相当一部分卵巢癌病例相关。从这些案例中得到的经验教训应该对今后处理其他类似案件有所借鉴。第三，由于卵巢癌的高死亡率，已经观察到应用越来越积极的肿瘤减灭疗法的趋势。我们认为，根据这里描述的案例，如果对所有案例不加区别地使用这一方法，将适得其反。我们打算用这些病例来说明对每一个病例进行个体化治疗的必要性。第四，由于抗肿瘤免疫是影响包括卵巢癌病例在内的所有癌症的肿瘤复制和预后的重要因素，但抗肿瘤免疫在卵巢癌中能够发挥作用的总体比例较低（< 20%），因而使得肿瘤复制的作用更具影响力和独特性。通过这些病例，我们将表明，即使在卵巢癌病例中没有自主复制，肿瘤也可能发生。如果未得到过度治疗，此类肿瘤的预后良好。在术后转移的情况下，总是会出现自驱动的肿瘤细胞。这些细胞可能由术后治疗产生，但尽管它们具有自我复制能力，转移能力似乎有限，临床病程未遵循大多数侵袭性复发性卵巢癌病例的临床病程。这些案例背后的隐藏机制将被进一步讨论。

案例描述

病例1：

患者女，42岁，2014年出现大量腹水。医院检查显示卵巢有巨大肿块（7-10cm）。患者有卵巢囊肿病史，并持续数年接受激素治疗。肿瘤标志物CA125显著升高（>1000）。因此怀疑为卵巢癌。该病例接受了手术，并根据肿瘤侵袭/分布情况，将该病例定为FIGO分期3C。因此，患者接受了术后辅助化疗，在进入观察期前完成了6轮含铂类药物治疗。肿瘤标志物CA125在手术和化疗后降至10以下（正常范围：0-35）。术后近两年，肿瘤标志物CA125开始缓慢而稳定地反弹，但仍保持在正常范围内。患者每隔4周进行3轮化疗，直至肿瘤标记物再次降至10以下。在她于2019年寻求我们对其病程回顾和未来前景的意见之前，该病例一直无明显异常。我们检查了她的手术肿瘤样本中的肿瘤复制模式以及是否存在任何形式的免疫。观察表明，这是一个典型的卵巢浆液性腺癌（图1，HE）。在整个肿瘤切片中没有确定的Ki-67阳性信号（图1，Ki-67）。相反，通过PCNA染色，在整个切片中有非常活跃的增殖信号（图1，PCNA）。未检测到抗肿瘤免疫，因为肿瘤中完全缺乏T细胞（图1，CD3）。因此，这些观察结果指出了一种非自主复制驱动生长的情况，而不涉及用于术后保护的抗肿瘤免疫[5]。基于这一评估，我们将该病例相对良好的术后预后归因于缺乏自我驱动的肿瘤复制。然而，我们还认为，观察期间发生的两起肿瘤标志物升高事件可能反映了早期的真实复发。这些复发可能是由自主复制的肿瘤细胞（不是来自原发灶，而是化疗突变的残留肿瘤细胞）驱动的（见下一个病例）。然而，这些复发被及早发现并通过化疗根除。截至2019年，该病例术后无病生存5年以上，我们认为该病例已达到临床治愈，无需进一步干预。手术后6年多，患者今天仍然健康。

图1：病例1中的肿瘤复制模式和抗肿瘤免疫的存在。对切除的原发灶切片进行HE、Ki-67、PCNA和CD3染色。提供了代表性区域的低（40倍）和高（100倍）放大率显微照片

病例2：

患者女，46岁，2014年因持续口腔不适就诊。影像学检查显示左侧卵巢有一个8.1x7.4x6.7 cm的肿块。肿瘤标志物升高（CA125=125，CA199=80）。患者有较长的卵巢囊肿病史（>10年）。疑似卵巢癌病例，患者接受了手术。病理报告显示左侧卵巢可见一个大的（11cm）透明细胞癌，右侧可见较小的肿瘤。肿瘤侵犯周围器官，但在盆腔外远处未发现肿瘤转移。FIGO分期为3C，安排术后辅助化疗。然而，在化疗期间，通过PET-CT检测到遍及腹腔和盆腔的各种小肿瘤结节。术后10个月（辅助治疗停止后5个月）进行的另一次PET-CT检查显示，在肝脏和脾脏之间的一个小肿瘤结节（1.3x0.8cm）中存在活性代谢信号（SUV>8），以及腹腔和盆腔的其他几个较小且活性较低的转移灶。患者随后抗拒进一步化疗，这些先前的转移瘤在未接受治疗的情况下逐渐消退。术后30个月，CT成像显示肝脾结节增大，大小为3.2x1.7cm。这个复发的肿瘤被第二次腹腔镜手术切除，可能有残留。术后安排了另外两轮化疗。第二次手术后6个月，敏感肿瘤标志物显著升高，CT成像证实手术部位复发结节2.9x2.5 cm。由于先前切除的手术不完整，被视为复发。2019年1月再次进行了第三次也是更长时间的手术。术后，敏感肿瘤标志物（CA125和CA199）恢复至正常范围，此后保持在低水平。此后，影像学检查显示无明显异常。患者随后到我们这里寻求复发风险评估。我们查看了所有三份既往手术样本，以寻找术后复发的线索。对原发灶样本的检查显示为卵巢透明细胞癌（图2A，HE）。肿瘤复制不是自驱动的，因为在整个肿瘤切片中没有Ki-67阳性染色（图2A，Ki-67）。相反，使用PCNA染色检测到活性肿瘤增殖（图2A，PCNA），表明这是一种非自主复制性生长，尽管肿瘤具有高度侵袭性。在肿瘤中没有检测到T细胞的存在，表明当时在该病例中没有共存的抗肿瘤免疫。这些观察结果与该病例在诊断和手术时无转移一致，但与术后远端复发不一致。我们查看了第二次手术的手术样本寻找线索。染色显示转移灶有两个模糊结构。大多数切除的肿瘤仍表现出透明细胞癌的特征，尽管从结构上看，转移灶在细胞间隙方面更“致密”（图2B，HE-1）。与原发灶不同，复发性转移是自我驱动的，以进行复制，因为观察到Ki-67的大量阳性染色（平均30-50%标记指数）（图2B，Ki-67-1）。PCNA染色也有接近100%的肿瘤细胞呈阳性（图2B，PCNA-1）。也不同于原发灶，T细胞存在于复发肿瘤中，尽管并非均匀分布于整个肿瘤。T细胞在肿瘤活动区呈散在分布（占整个肿瘤的70%，图2B，CD3-1），但在其余30%的区域聚集分布（图2B，CD3-2）。与此存在相关的是，肿瘤结构明显改变（图2B，HE-2），但肿瘤复制未丧失（图2B，Ki-67-2和PCNA-2），反映了免疫攻击和肿瘤破坏。这些观察结果支持这样的推测，即转移是由自我驱动的肿瘤复制建立的，而不是由非自主复制的原发灶中的常规肿瘤细胞建立的。这些自主复制细胞的来源尚不清楚，但怀疑与术后化疗有关（见下文讨论部分）。同时，随着的出现驱动自主复制的突变发生，免疫识别发生，伴随的抗肿瘤免疫产生。这种免疫力不足以控制整个转移的进程，但与转移灶共存并持续破坏部分肿瘤。随着肿瘤的完全切除，这种免疫虽然在数量上并不强烈，但可能形成有效的记忆保护以防止复发和转移[5]。但已知第二次手术不完全，随后的肿瘤复发表明这种免疫无法根除残留肿瘤。根据我们的经验，既往抗肿瘤免疫可能会随着肿瘤复发而恢复和增加。第三次手术的样本检查显示情况确实如此（图2C，CD3-2对比图2B，CD3-2）。复发肿瘤进一步趋于低分化，肿瘤细胞紧密堆积，结构不清晰（图2C，HE-1）。肿瘤复制的活性也增加了。Ki-67的标记指数较高（50-70%）（图2C，Ki-67-1）。在肿瘤周围发现大量T细胞，其结构类似淋巴结，具有生发中心（见标记Ki-67阳性细胞）和周围T细胞区（未显示）。与之前切除的样本相比，T细胞数量及其激活状态均显示出增强。完整手术后，这种免疫可能形成有效的术后保护，防止该肿瘤进一步复发和转移。根据这些观察结果和对既往病程的解释，我们得出评估，该病例在第三次手术后可能进入临床治愈阶段。病人今天保持健康。

图2：病例2的原发灶和转移灶中的肿瘤复制模式和抗肿瘤免疫的存在。对切除的原发灶（A）、首次复发转移（B）和再次复发转移（C）的切片进行HE、Ki-67、PCNA和CD3染色。提供了代表区域放大100倍的显微照片