癌症免疫检查点抑制剂治疗清除模型的进一步临床证据
【以下为译文，英文版原文参考：https://cskscientificpress.com/articles_file/365-_article1710910653.pdf】
摘要 自免疫检查点抑制剂(ICI)诞生以来的十年中，尽管在多项临床试验中取得了一些最显著和最持久的抗肿瘤反应，但这些疗效背后的真正作用机制仍未在临床环境中得到证实。目前适用于ICI治疗的工作模式存在严重缺陷，因为越来越多的临床观察结果对其提出挑战而非支持。另一方面，越来越多的证据表明，在现实世界的临床环境中使用的ICI治疗导致了许多疾病的加速进展和死亡。这种现象虽然在经常进行ICI治疗的临床医生中广为人知，但很少在公开场合提及，其真正机制仍无法解释。另外两项与ICI治疗相关的临床观察结果也未得到解释：一项是在许多患者中观察到的ICI治疗的“扳机效应”。这些患者由于各种原因停止了持续的抗体给药。尽管停用了针对PD1/PDL1的抗体，但之前的单次给药带来了持续的应答，有时持续数月甚至数年。另一个观察结果是，在某些情况下，治疗会引发严重的自身免疫性攻击。ICI治疗的公认模型对此类事件没有令人满意的解释。我们之前已经提出了ICI治疗的“清除”模型，可以解释所有令人困惑的临床观察结果。在此，我们继续介绍支持清除模型的案例证据。我们的观察表明，由抗PD1抗体激活的最持久和最显著的抗肿瘤免疫是由激活的PD1阴性T细胞实现的。基于目前主流的“封闭”模型，这一观察结果具有讽刺意味，因为针对PD1的抗体激活了PD1阴性抗肿瘤T细胞，这如何通过封闭模型实现？相反，这一观察结果是符合我们的清除模型预期的。此外，我们在真实临床病例中的发现对当前ICI治疗的临床应用提出了根本性的问题，并为寻找激活PD1阴性T细胞以实现持久抗肿瘤应答的方法指明了未来的方向。
介绍 多亏了过去十年的ICI治疗，今天我们已经很确定针对癌症的免疫反应是真实而强大的，如果以正确的方式激活，它可以灭活临床环境中几乎任何常见的肿瘤负担。然而，尽管在过去的几年里有很高的期望和炒作，ICI疗法到目前为止主要在各种临床试验环境中显示有效，但在实际应用中无效[1,2]。为什么这两种环境之间会有如此大的差异还不清楚。我们自己的经验表明，人们对其工作机制的认识存在混乱，因此，在大约40%的情况下，错误应用造成了伤害而不是获益[3]。根据ICI治疗的既定机制[4]，攻击肿瘤的T细胞释放IFN-γ，使肿瘤细胞表达PDL1，进而下调免疫反应，从而阻止免疫攻击肿瘤。ICI抗体封闭了表达PD1的T细胞与表达PDL1的肿瘤细胞之间的相互作用，从而使T细胞免受PDL1的抑制。不仅是我们，其他人也经历了ICI诱导的超进展[5][6][7][8]。现有的“封闭”模型无法解释ICI治疗的这种严重不良作用，因为超进展背后的原因是先前存在的抗肿瘤免疫丧失，尽管这个免疫之前不能完全控制肿瘤进展。有了这个微弱的免疫，在ICI治疗诱导的超进展出现之前至少可以维持对新发转移的控制。在ICI治疗诱导的超进展期间，这种能力被移除，于是转移灶得以形成。为什么在某些情况下，原本是为了激活抗肿瘤免疫的治疗会造成清除抗肿瘤免疫的效果？这种清除与抗体的“封闭”功能有何关系？尽管这种损害被广泛观察到，估计约占现实世界临床环境中随机选择患者的40%(我们自己的经验和观察)，但没有人来回答这些问题。
此外，另外两个令人困惑的临床观察结果也无法用“封闭”模型来解释。一个是在一些患者中观察到的“扳机效应”，这些患者由于各种原因只获得了一次使用该疗法的机会。他们的肿瘤对这种单次治疗表现出持续的应答，有些甚至会超过一年。大多数持久应答者在停止治疗两年后仍表现出持续的肿瘤消退[9-11][12]。为什么单次ICI抗体给药会引起持续的应答？这种效应如何用“封闭”模型来解释？如果没有周期性的抗原释放和刺激，如何用免疫学原理解释这种持续性反应？如果单次抗体给药就能引发这种效应，那么为什么开发ICI治疗药物的公司建议频繁(每三周一次)重复给予ICI抗体？难道他们没有注意到这种扳机效应吗？还是他们忽视了这一点，因为他们没有调查这一现象，也不想调查？同样，不仅没有这些问题的答案，甚至在文献中都没有提及这些问题，尽管有成千上万的关于ICI治疗使用和机制的出版物。另一个令人困惑的观察结果是与ICI治疗相关的自身免疫攻击，这是一种众所周知的，在临床上无法忽视的，与治疗相关的不良反应[13]。这不能用“封闭”模型来解释，因为与肿瘤细胞不同，出现自身免疫攻击的靶细胞上不表达免疫检查点配体(如PDL1)。以ICI治疗最常见的免疫不良反应——肺的自身免疫攻击为例，根据封闭模型，正常情况下攻击肺的免疫T细胞应受到免疫检查点的抑制，自身免疫的激活跟抗肿瘤免疫的激活类似，通过封闭T细胞上的PD1与正常肺细胞上的PDL1之间的相互作用来实现。但无论有没有自身免疫应答，正常肺组织并不表达PDL1。其他受自身免疫影响的组织和器官也未发现PDL1表达。而且PDL1抗体也可能导致自身免疫攻击，尽管几率较低，这一事实更令人困惑。那么，ICI抗体如何激发自身免疫攻击呢？同样，这个问题也没有答案。由于尚不了解ICI治疗诱导的自身免疫攻击背后的真实机制，因此没有标准来选择可能导致治疗引起的致命性自身免疫疾病的患者。
最近，通过我们自己的研究，我们提出了一种新的ICI治疗工作机制来取代当前的封闭模型。基于我们称之为清除模型的新模型[3]，肿瘤浸润T细胞的位置是关键的，因为位于间质中的PD1阳性T细胞容易被抗体结合，并被包括ADCP的各种机制清除[14]，而深度浸润肿瘤团块内部的T细胞由于缺乏抗体穿透和/或缺乏PD1表达而得以保留。这种清除会导致T细胞快速下降，随后是内稳态驱动的残留T细胞扩增。这就是抗肿瘤T细胞非抗原特异性激活的原因。这种初始激活导致那些能够深度浸润肿瘤团块的T细胞扩增，从而产生最有效的反应。这个模型虽然可以解释封闭模型无法解释的三个最令人困惑的观察结果，但仍然留下一些令人困惑的问题有待回答。最具挑战性的是在临床环境中持续给予抗体时的持续应答。如果T细胞的位置可以为一些深深浸润在肿瘤团块中的T细胞提供最初的隐藏位置，则随后的扩增将需要这些T细胞迁移出肿瘤团块并进入引流淋巴结以实现最有效的扩增。这种位置改变将使这些T细胞暴露于抗体介导的清除，除非这些T细胞不表达PD1。但临床观察结果表明，这些T细胞也可能表达PD1，易受抗体介导的清除影响。在相当多的病例中，我们观察到ICI抗体初次给药后的稳健应答在持续给药后转变为超进展(详见下文)。另一方面，有些患者在持续抗体给药但没有持续抗原释放的情况下却可以维持长期应答。如何解释这两种情况下的差异也是一个挑战。在本报告的以下章节中，我们引用四个真实案例来说明几个要点，这些要点共同构成了一幅更大的画面。综合观察和合理推断为我们提出的清除模型提供了坚实的支持。此外，它们指出了一个方向，在这个方向上，我们可能会找到一种方法来激活最有效的抗肿瘤反应。
病例证据
病例1：PD1抗体重复给药导致抗肿瘤T细胞清除和超进展 患者男，59岁，颈部有一个大肿块(图1-1)，经活检诊断为黑色素瘤。PET-CT检查显示出另外的一个骨转移(图1-2)。患者前额有一个鼓起的黑痣，但活检未显示恶性肿瘤细胞，因此该黑色素瘤的原发部位未知。患者向我们寻求治疗方面的帮助。我们首先检查了活检样本，以评估肿瘤复制模式和抗肿瘤免疫状态。分析显示肿瘤结构为典型的黑色素瘤，肿瘤细胞密集，细胞间缺乏间隙(图1-3，HE)。肿瘤复制活跃，Ki67的阳性率大约40-70%且深染(图1-3，Ki67)。病灶内有大量分散的T细胞(图1-3，CD3)。这些T细胞属于CD8亚型，部分呈激活状态。这些T细胞似乎具有抗肿瘤活性，因为肿瘤复制在T细胞较少的区域最活跃，
基于这些观察结果，我们认为这是一个肿瘤复制活跃同时伴有抗肿瘤免疫的病例。与大多数肿瘤确诊时相比，该病例的抗肿瘤免疫水平相对较强，尤其是肿瘤内的一些CD8 T细胞呈激活状态，T细胞与肿瘤复制之间存在明显的拮抗作用。此外，在这个病例中T细胞浸润的模式为“混合”型，根据ICI治疗的清除模型，该病例使用PD1抗体治疗可能获益[3]。另一方面，我们观察到肿瘤复制受到T细胞的抑制，表明在免疫攻击中肿瘤没有表达PDL1，因为那样的话通常会加深Ki-67染色[3]。商业第三方PDL1表达检测证实了这一点，该检测得出肿瘤无PDL1表达的结论(未显示)。在如此强烈的免疫攻击下，肿瘤细胞不表达PDL1的原因尚不清楚。因为PDL1的表达是由IFN-γ刺激的[15,16]，可能不是因为IFN-γ释放不足，因为我们看到肿瘤复制明显受到抑制，这是T细胞释放IFN-γ的标志。一定还有其他因素阻止肿瘤细胞表达PDL1。
无论肿瘤PDL1的表达如何，我们的清除模型[3]预测这是一个可以获益的病例。因此，我们建议采用PD1抗体治疗。与PD1抗体的主流使用方法不同，我们基于清除模型的使用基于抗体的扳机效应，除非必要，不需要重复给药。因为PD1阳性T细胞会被清除，而这种清除在不同患者中可能存在差异。这些患者可能表达了 FC 受体基因的不同等位基因，从而影响IgG1被巨噬细胞结合和T细胞被清除。所以我们在给予PD1抗体(Keytruda，200mg)之前和之后监测了患者的血细胞计数。血细胞计数表明，抗体给药后一天淋巴细胞下降23%(同时未见其他白细胞下降)。在接受ICI治疗监测的患者中，这种下降幅度并不大，通常在抗体给药后立即下降超过30%(我们未发表的结果)，表明T细胞清除可能并不严重。由于T细胞激活取决于残余T细胞内稳态驱动的恢复，因此少量清除会驱动少量恢复，并可能导致T细胞激活减少。
治疗两周后，我们观察到颈部肿瘤结节有应答。截至第5周，该结节已显著缩小至先前体积的20%以下(图1-4)。到第6周，这种应答开始停止，颈部肿瘤缓慢反弹。患者及其家属咨询的其他医生均将应答停止归咎于没有持续给药(每三周一次PD1抗体)和没有联合化疗。由于第一次PD1抗体治疗未显示任何短期进展的迹象(根据我们的清除模型，这一现象与PD1阳性抗肿瘤T细胞的暂时性清除相关)，我们认为两个月后再次重复治疗应该是安全的，但我们反对每三周重复给药一次，因为抗肿瘤T细胞可能被过度清除，导致肿瘤超进展而完全失去控制。尽管有我们的警告和解释，病人还是和他的家人一起接受了其他医生的建议。恢复PD1抗体连续给药后6周，肿瘤进展加速变得明显，颈部肿瘤迅速变大和变硬，先前的单个结节已分裂为四个突出结节，占据颈部相当大的面积(图1-5)。患者还出现了背部和腿部疼痛。根据我们之前的警告，我们意识到患者的抗肿瘤免疫功能衰竭，并因此出现了超进展。然而，治疗医师坚持认为，这是由肿瘤变异出的耐药克隆引起的，而不是抗肿瘤免疫的丧失。他们坚持继续进行抗体给药。为了解决关于肿瘤进展原因的争议，我们要求对颈部肿瘤再次进行活检，并再次进行PET-CT检查，以了解肿瘤进展是否仅限于颈部肿瘤，还是出现了新的转移。如图1-6所示，该PET-CT显示身体许多部位大量存在新的转移灶。进行肿瘤活检显示肿瘤团块内有活性增殖肿瘤细胞，无T细胞(图1-7)。总之，这些观察结果支持了全身抗肿瘤免疫完全丧失的结论，这一结果只能用抗体介导的T细胞清除来解释，支持了我们的ICI治疗清除模型。
ICI治疗后，应答从一个极端到另一个极端大幅波动的原因是什么？我们基于清除模型的分析指出，在单次给予PD1抗体后，抗肿瘤T细胞开始激活。继续给予抗体导致激活的T细胞几乎完全被清除并造成超进展。在停止给予更多抗体后，抗肿瘤T细胞随后恢复，形成自发的肿瘤控制。但我们并未预期紫杉醇单疗程化疗后会出现显著的持续抗肿瘤反应，最终导致患者死亡。黑色素瘤免疫治疗后的黑色素细胞色素脱失已有描述。通常与自维持的抗肿瘤免疫反应有关，并常常导致癌症被根除[17]。
显然，这种类型的持续反应通常与化疗无关，更不用说使用普通药物进行单疗程化疗。在本病例中观察到的这种持续应答的真正原因不是来自化疗药物的作用，而是来自恢复的抗肿瘤T细胞的激活。由于我们观察到ICI治疗的最佳反应是由PD1阴性T细胞介导的(见后文病例3部分)，因此我们回去检查了第一份和第三份活检样本中T细胞的PD1表达状态(因为第二份活检不含T细胞)。如图所示(图1-9)，在确诊时进行的首次活检样本中，肿瘤团块内几乎所有T细胞均表达PD1。形成鲜明对比的是，在连续PD1抗体停止后9周的自发性肿瘤控制时进行的第三次活检中，肿瘤中有大量T细胞，但这些T细胞中只有不到一半表达PD1。我们不能断定这些PD1阴性T细胞在化疗后持续抗肿瘤应答期间会保持PD1阴性 ，但基于我们对其他病例(病例3)的观察，我们认为会。甚至尚不清楚化疗后的持续抗肿瘤反应是否是由单疗程化疗激活的，也可能是化疗前已经观察到的自发T细胞恢复过程的延续和扩大。在病例3和4中，我们将看到PD1抗体对PD1阴性T细胞的选择过程，即仅使PD1阴性T细胞扩增。如果在观察到超进展后未停止PD1抗体治疗，则在最终仅剩PD1阴性T细胞时，我们可能会看到随后的肿瘤消退。由于ICI治疗后一些最持久的反应是在持续抗体给药下进行的，这可能是一个合理的解释。
病例2：肿瘤表达PDL1不是避免ICI治疗后超进展的安全指征 在上述病例中，我们的评估和第三方免疫组化分析均显示PDL1表达状态为阴性。这并不是不应在该病例中使用抗PD1的原因，因为在首次PD1给药后非常有效。另一方面，主流指南通常使用肿瘤的PDL1表达状态来选择ICI治疗候选人。临床数据已经确立了肿瘤细胞的PDL1表达水平与ICI治疗应答之间的相关性[18]。尽管此后许多研究表明，PDL1阴性状态的患者也可受益于ICI治疗，但PDL1在肿瘤中的高表达通常是更好应答的指标[19]。鉴于肿瘤表达PDL1是受T细胞释放的IFN-γ刺激[15,16]，因此肿瘤细胞PDL1的这种高表达至少表明抗肿瘤T细胞位于附近并且具有释放IFN-γ的能力，这是Th1型抗肿瘤免疫应答的标志。即使采用我们的清除模型，T细胞在肿瘤中的这种邻近位置也经常表明肿瘤团块中存在混合浸润的T细胞，这是ICI治疗可能获益的一个指标。但PDL1的肿瘤表达状态并不能保证不会发生ICI抗体对抗肿瘤T细胞的清除。清除的保护因素是:1) T细胞位于肿瘤团块内；2)T细胞上的PD1表达缺失，但T细胞是否刺激肿瘤细胞表达PDL1并不重要。以下案例是这一点的例证。
患者男，52岁，因持续咳嗽和胸痛被诊断为肺癌。PET-CT检查显示左肺有一个4CM的原发灶，全身有多个转移灶(图2-1)，从而确定为IV期。基因检测显示没有任何可用的靶向药。这位患者是一名经过培训的内科医生，他熟悉目前关于IV期肺癌的治疗指南，他来到我们这里进行预后评估并寻求治疗建议。我们要求通过检查活检样本来评估肿瘤复制模式和共存免疫状态。对其活检样本的分析显示(图2-2)为低分化腺癌(图2-2，HE)，具有少量自主复制肿瘤细胞(图2-2，Ki67)，细胞核增大，Ki-67深染，这是局部炎症趋化活跃的迹象(症状加重的原因)。活检样本中存在大量T细胞(图2-2，CD3)。T细胞主要分布在肿瘤小团块周围的间质中，但有部分明显浸润在团块内部，与肿瘤细胞形成混合浸润模式。这些T细胞大多为CD8亚型，未显示激活状态。总之，这些观察结果将该病例归为伴有多发转移同时具有相对较强共存免疫的一类。根据TNM分期，这是一个IVb期，预后最差的非常晚期的癌症，而根据我们加入抗肿瘤免疫状态定义的分期系统，该病例并不像看起来那样绝望，如果抗肿瘤免疫能够被激活以灭活大多数转移，则该病例可以挽救，具有良好的长期预后。基于这一评估，我们建议使用ICI疗法激活抗肿瘤免疫，即使用PD1抗体的单一疗法。需要指出的是，第三方对肿瘤PDL1表达的分析也支持选择ICI治疗，该分析显示>90%的肿瘤细胞表达PDL1(图2-3)。然而，根据对患者活检样本的观察，我们向患者明确表示，PD1抗体治疗只能给药一次。
这被清除模型解释为当那些间质浸润T细胞被抗体清除时的短期效应。由于这些T细胞原本负责控制肿瘤的进展，因此去除它们将导致肿瘤反弹。随后，在接下来的12周内，所有肿瘤标志物快速且持续下降，此时仅观察到标志物CEA反弹。基于我们之前描述的清除模型，预期单次PD1抗体治疗后会出现持续应答[3]，但CEA在另外两种标志物没有反弹的情况下出现反弹是意外的，表明是逃逸事件，而不是ICI治疗激活的抗肿瘤免疫普遍衰退。为了证实这一点，我们要求进行第二次PET-CT检查。图2-5显示了两种PET-CT结果的比较。这两次检查之间的肿瘤负荷存在显著差异，说明单次剂量PD1抗体激活了显著的抗肿瘤反应。这种强烈而持久的反应支持了清除模型所解释的扳机效应[3]。此外，我们还发现了CEA反弹的原因，因为在所有先前确定的结节消退中，有一个新发的骨转移(图2-6)。这清楚地表明，正在进行的抗肿瘤免疫无论强度如何，都无法识别该骨转移。由于其他两种肿瘤标志物(Cyfra21-1和NSE)未出现反弹，因此这两种标志物并不代表此处骨转的复制，因而此处很可能是一种新的突变，也是一种免疫逃逸。
鉴于总体肿瘤消退伴有一处逃逸转移，我们建议对该骨转移进行放射治疗，同时让其余肿瘤继续消退。但患者及其家属咨询的其他医生坚持给予更多的PD1抗体。虽然我们解释了ICI治疗具有扳机效应的原因，以及初次PD1抗体显示了三个月的持续应答支持这一观点，并且该肿瘤中的T细胞浸润模式可能无法承受ICI抗体的重复给药，但患者选择对新发现的骨转移灶进行放射治疗，同时重复PD1抗体给药。放疗和连续两次PD1抗体治疗后两个月，肿瘤标记物显示快速反弹，表明肿瘤失去控制。患者回到我们身边寻求解释和建议。我们要求进行第三次PET-CT检查，以观察肿瘤负荷的变化。如图2-7所示，截至第三次PET-CT检查时，包括原发灶在内的一些先前消退的肿瘤明显复发。此外，还有一些新发现的转移灶。通过第二次PET-CT(图2-6)鉴定的单个骨转移灶(经放射治疗)显示代谢减少。结合迅速反弹的肿瘤标志物，这些观察结果表明，负责抑制肿瘤的T细胞被重复的PD1抗体清除，因此我们看到原发灶迅速复发，并出现新的转移灶。相反，由于第二次PET-CT检查发现的单个骨转移是免疫逃逸，因此T细胞清除不会影响其生长。事实上，这个转移灶受到放射治疗的抑制，并表现出代谢活性降低。 由于肿瘤的PDL1表达极高，该病例被认为是ICI治疗的潜在高应答者(图2-3)。另一方面，由于低分化的肿瘤结构和肿瘤团块存在混合T细胞浸润，清除模型也认为其是ICI治疗的潜在受益者(图2-2)。ICI治疗的实际反应是显著的抗肿瘤效应，在初始ICI治疗前后进行的两次PET-CT检查证实了这一点(图2-5)。随后的PD1抗体给药是在三个月后进行的，当时除一种突变逃逸外，肿瘤控制仍然明显。之前的显著应答到后来的超进展这一逆转很难归咎于第二次PD1抗体给药，即使是基于清除模型也是如此。
病例3：在持续的PD1抗体给药中得以存活的是PD1阴性的T细胞 尽管上述两例病例显示，由于持续的ICI抗体给药，T细胞被清除并导致超进展，但临床试验显示，一些病例接受了多次的抗体治疗，但仍然有应答。这些病例背后的原因是什么？重复的抗体给药是持续应答的必要条件或原因吗？基于清除模型的一个预测是，在重复ICI抗体给药期间能够存活的T细胞必须是PD1阴性的，否则它们会很早就被清除。根据我们在上述两种情况以及发生超进展的其他一些病例中所见，如果ICI抗体确定会导致T细胞清除，则重复给予抗体的次数不应超过两次。如果一个病例接受了两次连续给药治疗，但没有发生T细胞清除，则采用更多的抗体治疗也不会发生。下面的例子很好地说明了这一点。
患者男，60岁，在正常体检时发现左肺有一个大肿块。活检显示为低分化腺癌。可能的局部淋巴结转移很少，未发现远处转移。由于原发肿瘤较大(> 7CM直径)，外科医生建议进行几轮新辅助化疗联合PD1抗体，观察是否能缩小肿瘤，使手术更容易。患者的一位家属向我们寻求建议。我们要求查看活检组织的肿瘤复制模式和抗肿瘤免疫状态。如图3-1所示，这是一种低分化腺癌(HE)，具有中等活跃的复制(Ki-67)。重要的观察结果是，活检样本中几乎不存在T细胞(CD3)。
这个染色观察与原发灶较大却无任何症状的病史一致，但与没有远处转移的情况有些不一致，而抗肿瘤免疫存在与否对这两个特征均有重要影响。基于这些观察结果，我们担心共存免疫免疫缺失可能是真的。此后，我们建议通过手术切除原发肿瘤，并将切除的肿瘤组织用于制备一面。预防复发将依赖于疫苗诱导的抗肿瘤免疫。家属及患者选择接受医院安排，进行化疗联合PD1抗体。几个月后，该家属回来报告患者已完成三轮化疗联合PD1抗体治疗，肿瘤大小缩小> 30%，外科医生已准备好进行手术。我们建议，在新辅助治疗未激活抗肿瘤免疫的情况下，应保留肿瘤组织。手术后，我们检查了原发灶样本是否存在抗肿瘤免疫。如图3-2所示，仍残留部分肿瘤，呈类似低分化结构(HE)。肿瘤复制仍保持活性，与活检样本相似(Ki-67)。令我们惊讶的是，与活检样本中不存在T细胞形成明显对比的是，肿瘤中存在大量T细胞积聚，主要位于肿瘤结构之间的间质中(CD3)。
这是一个惊喜，因为根据我们9年的实践和经验，新辅助化疗只能在证实存在抗肿瘤免疫的腺癌病例中提升抗肿瘤免疫，而像这个病例这样不存在抗肿瘤免疫则无法提升。第二个惊喜是T细胞激活后导致初始的PD1表达，在持续PD1抗体给药的情况下，PD1阳性T细胞将被清除。此外，手术样本中的大量T细胞在三次重复抗PD1给药后得以存活，如果ICI治疗的清除模型是正确的，那么它们应该大部分(如果不是全部)应该是PD1阴性的。为了检验这一预测，我们对手术样本进行了PD1表达染色。如图3-3所示，CD3和PD1染色之间的比较表明，肿瘤中大多数CD3阳性T细胞不表达PD1。这些T细胞均为CD4和CD8亚型，大多处于激活状态(圆形细胞且细胞膜着色)。有趣的是，在T细胞簇中有一些T细胞显示PD1阳性。但这些T细胞大多未被激活，呈细长的不规则状，且整个细胞均匀着色。
总之，这些观察结果支持了我们的ICI治疗清除模型，即在重复抗体给药后存活的激活T细胞必须是PD1阴性。少数PD1阳性T细胞由于位于肿瘤内，可能在重复抗体给药后得以存活。这些T细胞很可能在进入肿瘤前为PD1阴性，在肿瘤内变为PD1阳性。有一些报道表明，PD1的表达是肿瘤内T细胞耗竭的一个特征[20][21]。应该指出的是，在这种情况下使用ICI疗法并不符合预筛选标准，无论是基于主流方法的PDL1表达，还是我们的清除模型。我们不推荐ICI治疗的原因是该病例总体上缺乏抗肿瘤免疫。ICI疗法不能激活一开始就不存在的东西。其次，肿瘤结构虽然类似低分化，但确实含有大面积的间质，这些区域很容易被针对PD1的抗体穿透，从而导致T细胞清除。只有当我们看到肿瘤中T细胞呈混合型浸润时，我们才可能建议使用ICI治疗。在这种情况下，我们认为ICI治疗的条件不合适，因此我们不建议使用它。从这个意义上说，与上述两个案例相比，这个案例是幸运的，因为这个家庭违背了我们的建议，却以一个好的结局收场。基于我们在手术样本中观察到的强烈抗肿瘤反应，我们告知家属，该病例很可能在手术后治愈，无需额外的辅助治疗。大量PD1阴性细胞被激活的原因尚不清楚。它们可能来自我们在活检样本中未观察到的肿瘤内的一些PD1阴性T细胞的扩增，或者来自肿瘤内的一些PD1阳性T细胞激活后变成PD1阴性，并在持续的抗体给药下扩增。我们无法判断，因为在活检样本中看不到T细胞。
病例4：PD1阴性T细胞的来源 在上一个病例中，最终肿瘤的手术样本中存在大量PD1阴性的T细胞。由于ICI治疗前活检样本中不存在T细胞，因此我们无法判断这些PD1阴性T细胞来自何处。根据我们的清除模型，T细胞不是必需为阴性，只要它们的位置在肿瘤内部，而不是在间质中，就不会被PD1抗体清除。但如果它们最初为PD1阴性，则它们的激活和扩增不受抗体的影响。病例1和2还表明，通过ICI治疗激活T细胞不一定会使T细胞变成PD1阴性，或者随后的抗体给药不会清除激活的抗肿瘤应答。那么，是什么因素决定了被ICI疗法激活的T细胞上是否会表达PD1呢？后续扩增是否需要重新扩增PD1阴性的T细胞群，或者在ICI治疗诱导的T细胞激活后，PD1阴性T细胞可以从PD1阳性T细胞群转化？在接下来的案例中，我们调查了另一个案例以寻找线索。
患者男，50多岁，被确诊为食管癌后进行化疗联合ICI治疗的新辅助治疗。经过两轮治疗后，肿瘤应答不明显，医生手术切除了原发灶。术后，就复发风险向我们咨询。于是我们研究了手术样本以寻找线索。因为我们知道患者接受了两轮联合PD1抗体的连续化疗，所以我们预期这个样本中大多数或所有存活的T细胞应为PD1阴性。如图4-1和图4-2所示，事实上也确实是这样。肿瘤表现出典型的鳞状细胞癌形态，以不规则的肿瘤团块散在大片间质中。肿瘤复制活跃，在肿瘤边缘>70%的肿瘤细胞被Ki-67深染。肿瘤团块周围的间质中聚集了中等数量的T细胞。这些T细胞大多为CD8，大多被激活，且大多数不表达PD1。少数PD1着色的细胞未处于激活状态(图4-2)。
基于这些观察结果，我们认为该病例的术后预后良好，很可能实现临床治愈。与此同时，我们对这些在PD1抗体介导的清除中存活下来的PD1阴性T细胞的来源感到好奇。它们可以从PD1阴性群体中扩增出来，或者在内稳态介导的激活过程中从PD1阳性T细胞转化而来。为了回答这个问题，我们回去检查了新辅助治疗前的活检样本。如图4-3和4-4所示，肿瘤具有典型鳞状细胞癌结构（HE），肿瘤复制活跃(Ki-67)。瘤区内有部分T细胞，但多位于间质(CD3)，且多为PD1阴性。因此，这一观察结果解释了为什么这些T细胞在重复的PD1抗体治疗后得以存活而未被清除，尽管它们主要位于间质中。此外，比较活检和手术样本之间的T细胞数量和激活状态，发现数量有所增加，激活状态有所提升(手术样本中T细胞形状更圆)。这种T细胞应答的增加可能是ICI治疗的结果。如果是这样，ICI治疗后大量的PD1阴性T细胞就可能是从先前的PD1阴性T细胞群体中扩增出来的。
讨论 使用PD1/PDL1抗体的ICI治疗已在临床应用了十多年。在临床研究中报道了许多激动人心的研究结果。然而，这种疗法在现实世界中的应用并未显示出与临床试验所报道的类似功效[1,2]。ICI抗体的许多超说明书使用，特别是在中国可以以相对较低的成本获得国产抗体，被绝望的患者作为“最后希望”(我们的观察)。尽管ICI疗法被大量滥用，但越来越多的医生开始意识到这种疗法的局限性及其有害影响(我们的个人交流)。ICI治疗的伤害尚未得到很好的讨论，因为这些伤害无法用ICI治疗的适应机制来解释。令人困惑的是，一种旨在激活抗肿瘤免疫的疗法实际上可能会损害抗肿瘤免疫，从而导致肿瘤加速进展，因此大多数医生选择忽视这一点，特别是在他们发现通过联合化疗似乎可以防止超进展之后。但事实是，ICI治疗的伤害从治疗第一天就存在，化疗仅将肿瘤进展(包括新转移灶的建立)延迟至几个月后，因此似乎与ICI抗体给药无关，而是“正常”无效。如果通过监测敏感的肿瘤标志物进行密切随访，仍可观察到T细胞清除导致的肿瘤复制反弹，无论是否化疗(我们未发表的观察结果)。如果目前适用于ICI治疗的工作模型(封闭模型)不能解释治疗的有害影响，那么它一定是错误的或不完整的。因此，我们之前已经提出了另一种称为“清除模型”的ICI治疗工作机制，以取代我们称为“封闭模型”的主流的工作模型[3]。尽管新模型可以解释所有封闭模型无法解释的令人困惑的临床观察结果，但仍有一些关键预测有待证实。在这些预测中，有一个不可避免地具有讽刺意味：由重复PD1抗体给药激活并持续存在的抗肿瘤反应必须由PD1阴性T细胞介导。这种矛盾预测的原因基于清除模型的关键：所有表达PD1的T细胞都应通过巨噬细胞依赖机制(如ADCP)被清除[22]。虽然我们认为必须是这种情况，但我们拒绝在我们自己的病例中通过重复使用抗PD1抗体来证明，因为我们知道这不是必需的，而且也可能是有害的，如本报告中的病例1和2所示。然而，反复使用ICI抗体在临床环境中是一种常见做法，因此当一些患者前来咨询时，我们就有机会观察其效果。与病例3和4中的患者一样，在手术切除原发灶之前，对其进行了重复的PD1抗体治疗。如果他们是我们的患者，我们不会建议重复使用ICI治疗，甚至不建议使用ICI治疗，如病例4，因为T细胞的位置主要在间质中(图4-3)。然而，这些患者在未咨询我们建议的情况下接受了治疗，因此，在ICI治疗后未发生超进展的病例中，我们可以观察到重复ICI治疗的效果。结果表明，在这种结果下，存活的T细胞实际上大多为PD1阴性。仅这一观察就证实了我们基于清除模型的预测。需要指出的是，我们赖以证明我们预测的方法是寻找反例。即使是仅有一个病例，在重复ICI治疗后立即大量扩增的T细胞呈PD1阳性，也说明我们的清除模型存在缺陷。相反，如果连续7个以上的病例其结果与病例3和4相似，则具有统计学意义(p<0.01)，那么清除模型就成立。我们正在收集病例以检验这一预测，并将在得到结论时予以报告。
值得注意的是，观察到PD1阴性T细胞主要负责ICI治疗后的持续应答。PD1是一种在激活的T细胞表面表达的分子[23]。但许多研究也表明，PD1的表达是肿瘤环境中T细胞耗竭的标志[20][21]。对PD1表达的总体分析表明，它是T细胞功能的负调节因子。另一方面，肿瘤细胞受到IFN-γ的刺激而表达PDL1[15,16]。因此，存在肿瘤团块内的肿瘤浸润T细胞与表达PDL1的肿瘤细胞相遇的情况。净效应是抗肿瘤T细胞和肿瘤同时存在，这种情况我们称之为共存免疫。许多人倾向于认为，生长中的肿瘤内部的抗肿瘤免疫可能已“耗竭”，但很少人意识到其“功能性”。这些肿瘤浸润性T细胞的功能包括：1)限制肿瘤的生长(增殖/复制)速率；和2)限制新转移灶的建立。当T细胞被去除时，这些功能在动物模型中很容易观察到，但在人类癌症患者中很难识别，直到最近ICI治疗带来了许多超进展病例。ICI治疗诱导的超进展的本质是抗肿瘤T细胞的清除，许多人认为这些T细胞是与生长中的肿瘤共存的耗竭细胞。通过上面这些观察，我们不应认为这些共存的T细胞“衰竭”和“无功能”，而应认识到它们作为功能性抗肿瘤T细胞的重要作用。
这些肿瘤浸润性T细胞可以被激活，并打破肿瘤和免疫之间的平衡，以至于在短时间或更长的时间内，抗肿瘤免疫相对肿瘤进展更占优势，并导致肿瘤消退。当这种控制持续时，可能达到完全灭活肿瘤的程度。在许多情况下，抗肿瘤免疫的这种激活是通过化疗实现的[24]或者偶尔通过放疗实现。这种激活似乎依赖于对肿瘤杀伤过程中同步的抗原释放[25]。这与免疫学的一般规律相一致，即适应性反应是由特异性抗原驱动的。根据目前的封闭模型，ICI疗法不是免疫激活疗法，而是通过封闭免疫检查点分子之间的相互作用，释放抑制的T细胞，恢复对肿瘤抗原的攻击。根据抗原驱动反应的一般规律，ICI治疗释放的T细胞本应通过其他抗原释放的过程被激活，但由于肿瘤表达免疫检查点配体(如PDL1)而被下调，使其不能破坏肿瘤细胞。但实际上，在没有化疗等任何抗原释放干预的情况下，ICI治疗可能会激活大量持续的T细胞应答。那么，ICI治疗是如何实现这种T细胞激活的呢？封闭模型不能解释这种效应。前面所描述的所谓“负调节”和ICI抗体如何释放这种调节尚未在使用ICI疗法的患者中得到证实。相反，我们的观察一再表明，肿瘤表达PDL1不会使T细胞失活，而只是使肿瘤细胞本身对T细胞释放的因子如IFN-γ的抑制不敏感[3]。封闭模型不能解释为什么封闭T细胞上的PD1会使肿瘤细胞再次对T细胞介导的攻击敏感。另一方面，我们提出的清除模型可以提供解释。通过巨噬细胞依赖机制(例如，ADCP)清除与PD1抗体结合的PD1阳性T细胞。这个清除会导致T细胞暂时的内稳态失衡，随后任何残留的T细胞都会扩增。当所有抗肿瘤T细胞均为PD1阳性并清除时，将会出现短期的肿瘤控制丧失和可能的肿瘤进展。在许多情况下，这就是即使在单次ICI抗体给药的情况下也出现超进展的原因。但是，当一些T细胞(尽管PD1呈阳性)隐藏在抗体结合不到的肿瘤团块内部时，它们可能会通过内稳态恢复而被激活。这种激活导致T细胞数量增多，并改变T细胞的激活状态。这些T细胞再次浸润和攻击肿瘤，产生抗肿瘤反应。在病例1和2中，这似乎是PD1抗体最初使用后的情况。但是，从这两个病例随后的超进展来看，内稳态激活本身似乎并不会产生永久的PD1阴性T细胞。PD1阴性T细胞如何产生的问题仍然是个谜。但总有这种可能性，即共存免疫中存在一些天然的PD1阴性T细胞，在反复的PD1抗体介导的清除下，这些T细胞会比PD1阳性T细胞得到更多的扩增。病例4说明了这种可能性，尽管T细胞位于间质中使得它们更容易被PD1抗体完全清除。因此，清除模型解释了T细胞是如何在不释放抗原的情况下被激活的，以及过度清除和超进展的原因。
在新的证据下，特别是存在PD1阴性T细胞主导的应答，清除模型得到进一步加强和满足。在选择ICI治疗之前，我们应该考虑两个因素：1)T细胞以混合模式浸润肿瘤，如前所述[3]；和2)共存免疫中存在一部分PD1阴性的T细胞。否则，我们应避免选择ICI治疗，因为当抗肿瘤T细胞位于间质中且大多数为PD1阳性时，我们担心对抗肿瘤T细胞的清除会导致超进展。此外，如病例1和2所示，当出现ICI治疗的扳机效应时不应该重复ICI抗体给药，这可能导致随后的抗肿瘤T细胞被清除。在某些情况下，重复PD1抗体给药造成的选择性压力可能有助于PD1阴性群体优先扩增。但目前临床证据尚不确定。病例1可能最终通过重复抗体给药选择了PD1阴性T细胞，但在最终建立PD1阴性应答之前的清除和超进展是致命的，如果不进行ICI抗体的重复给药，则可以避免。现在，我们一直拒绝重复ICI抗体给药。有了这些选择标准和适当的实践，我们完全避免了与ICI治疗相关的超进展。与此同时，我们选择接受ICI治疗的病例中，应答率超过70%。20%无应答者似乎属于“清除缺陷”情况，即T细胞根本没有被ICI抗体清除。这可通过监测抗体给药后的淋巴细胞是否减少来观察到。根据清除模型，这可能是由于表达某些Fc受体亚型的宿主巨噬细胞对ICI抗体的Fc受体序列缺乏识别所致[26]。因此，未观察到抗肿瘤免疫的激活或清除。我们将在以后的另一篇文章中讨论这一现象。
如果PD1抗体因其靶向PD1阳性的抗肿瘤T细胞而具有抗肿瘤效应，那么在由PD1阴性T细胞介导的持续应答中，重复使用此类抗体有何意义？目前ICI治疗的临床实践是每三周重复进行抗体给药。一些持续应答者在1-2年内接受了数十剂抗体。有这个必要吗？ICI药物开发商当然没有证据证明有必要连续给予PD1抗体。其持续给药是基于封闭模型的自然思维。另一方面，基于清除模型，ICI治疗具有扳机效应，仅需单次剂量的抗体即可产生T细胞激活和抗肿瘤应答。病例1和2在初始治疗后证明了这一点。这两个病例还表明，重复给予抗体可能会将先前的抗肿瘤反应逆转为超进展。我们没有真实世界临床中发生过多少此类病例的准确描述，但根据我们自身的经验，约40%经ICI治疗的病例最终失去了对肿瘤的控制。ICI治疗的这种高损害与利益比可能解释了ICI治疗的低应答率和在实际使用中缺乏明确效果的原因[1,2]。另一方面，自从我们在认识到清除模型的15个月以来，我们在选择潜在应答者和避免所有ICI治疗有害使用方面建立了> 90%准确性的记录。在我们不知情的情况下使用了ICI治疗并产生危害的少数病例中，没有例外的情况是，如果由我们来评估这些病例是否适合使用ICI治疗，我们都不会推荐。这些临床记录表明清除模型一定是正确的。如果被主流医学采用，许多生命可以被拯救。毕竟，ICI治疗是癌症管理的一个重大发展，它就像一把双刃剑，可能对患者有利，也可能对患者有害。通过了解其真正的工作机制，我们应该能够在预防伤害的同时获益。
参考 26. Daeron, M., Fc receptor biology. Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 203-34.
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