抗肿瘤免疫是预防癌症手术后复发的决定性因素

Xin Chen1, Qi Wang2, Xu Zhang3, Hui Zhang3 and Kangla Tsung3*

1大连医科大学第二医院普外科，中国大连 

2武汉市武汉大学人民医院胃肠外科，中国武汉 

3探论癌症临床管理研究所，中国北京

【以下为译文，英文版原文参考：Antitumor Immunity as Determining Factor for Prevention of Post-Surgery Cancer R.pdf】

摘要

癌症手术是癌症治疗中最古老的方法，也是一种有效的癌症治疗方法，可以切除可见的肿瘤，并能导致长期的临床治愈。然而，手术治疗癌症的机制尚不清楚。传统的想法是手术能在肿瘤扩散之前有效地切除所有肿瘤，从而治愈肿瘤。然而，随着近年来对肿瘤切除后仍能持续存在的循环肿瘤细胞检测的研究，越来越清楚的是，在临床能够检测到之前，肿瘤的早期扩散是肿瘤发展的一个常见过程。那么，一个重要的矛盾问题是局部治疗，如手术切除如何治愈像癌症这样的全身性疾病？我们假设的肿瘤转移和抗肿瘤免疫之间的相互作用回答了这个问题。该模型，我们称之为“术后肿瘤复发窗口模型”，表明肿瘤转移的建立在原发肿瘤切除后具有L型动力学。同样，由于缺乏抗原刺激，术前伴随的抗肿瘤免疫也会在术后衰退。能否建立新的转移取决于这两个过程的平衡。在这里，我们提出动物研究证据来支持这个模型。我们还举例说明该模型如何应用于预测个别癌症患者的术后预后。

介绍

癌症手术是实现实体瘤临床治愈的最可靠的治疗方法。这种疗效的主流观点是基于这样一种观点，即成功的癌症手术取决于正确的分期，并且在癌症扩散之前进行，因此相信“早期检测导致早期治疗和治愈”。然而，对癌症患者的许多历史观察表明，癌症手术只能实现暂时缓解，肿瘤复发可能发生在原发性癌症手术切除多年后[1，2]。最近对更敏感的肿瘤细胞检测方法的研究一再表明，肿瘤扩散是癌症临床检测之前的早期过程，循环肿瘤细胞在癌症手术成功后很久才出现，[3-7]。因此，现有证据与这一理论不一致，但没有提供替代解释。肿瘤免疫学家一直认为共存的抗肿瘤免疫不仅能够控制原发灶的生长，而且能够控制建立转移灶[8-10]。但是，尽管有这种理论和动物肿瘤模型中的支持证据，尽管抗肿瘤免疫已经越来越受欢迎，但这种解释并没有得到临床的接受。例如，许多研究已经证明了手术肿瘤组织中T细胞浸润的预后意义，支持了强抗肿瘤免疫与术后更好生存相关的假设[11-17]。但是，即使在概念上接受了这种解释，但这种解释在单个病例中的术后预测的实际临床应用仍然缺失。一个主要的障碍来自缺乏适当的动物模型证据，表明抗肿瘤免疫可以防止术后复发。这是相当技术性的，因为所有转移性肿瘤模型都是没有共存免疫的肿瘤，而具有共存免疫的肿瘤不会复发，特别是手术后的转移。虽然这一观察结果与抗肿瘤免疫具有保护作用是一致的，但传统观点认为，由于缺乏转移形成能力，这种模型缺乏临床相关性。此外，癌症手术临床环境中最严重的挑战是“延迟复发”，即癌症复发发生在手术后数年。目前尚不清楚复发延迟的实际原因，但对肿瘤浸润的回顾性分析表明是免疫学原因，而不是肿瘤生物学原因。基于能够形成转移的播散性肿瘤细胞会发生转移的假设，原发灶切除后播散性肿瘤细胞形成转移的频率应随着时间的推移而逐渐降低，并越来越多的耗尽有能力的肿瘤细胞种子。另一方面，抗肿瘤免疫将识别新建立的转移灶并摧毁它们，但是随着肿瘤抗原刺激的减少，我们预计抗肿瘤免疫会降低到一个点，在这个点之后，它不再对新建立的转移灶有保护作用。这两个过程之间的关系如图1A所示，被称为“术后肿瘤复发的窗口模型”。因为转移瘤的形成过程很大程度上是由肿瘤的生物学特性决定的，而肿瘤的生物学特性是个性化的，并且难以控制，所以减少术后转移瘤的最合理的方法是扩大和延长免疫保护期（图1B）。

从这个模型中得出三个清晰的预测，可以在动物模型中进行测试。第一，术后肿瘤复发与肿瘤免疫原性相关，因为具有强共存免疫的免疫原性肿瘤在原发灶切除后复发的几率非常低，而无共存免疫的非免疫原性肿瘤在原发灶切除后可能复发。这是可测试的，因为免疫原性和非免疫原性小鼠肿瘤模型定义明确且可用。第二，如果抗肿瘤免疫负责术后防止肿瘤复发，那么在手术后去除或抑制这种免疫应导致肿瘤复发增加。这是一个可测试的预测，因为通过抗体去除T细胞是一种明确的抑制特异性免疫的方法。特异性免疫的功能也可能受到广泛化疗的干扰，导致骨髓抑制，因为化疗是一种常见的术后辅助治疗。第三，如果手术后残余共存免疫的强度负责防止肿瘤复发，则手术前抗肿瘤免疫水平的增加应导致残余抗肿瘤免疫的增加，并应导致手术后肿瘤复发的减少。这是一个可测试的预测，因为我们以前的研究表明，免疫原性肿瘤模型中的化疗结合白细胞介素-12（il12）是提高抗肿瘤免疫水平的明确方法，[18-22]。由于新辅助化疗常用于癌症手术，因此该试验具有临床相关性。此外，这是通过术前操作扩大术后免疫保护的主要方法（图1B）。如果被证明是真的，那么就为使用免疫刺激因素作为手术时机的选择提供了坚实的理论基础。在本研究中，我们使用动物肿瘤模型进行实验和分析，以支持这三个预测，从而证明抗肿瘤免疫是术后预防肿瘤复发的关键因素的概念。随着这一假设在动物模型中得到证实，我们也提供了一些初步数据来将这一方法转化为人类患者。

图1：肿瘤术后复发窗口模型（A）和基于该模型的减少术后复发的解决方案（B）。红线代表了在稳定条件下由播散的肿瘤细胞建立术后转移的动力学。绿线代表了抗肿瘤免疫功能衰退的水平随着时间的推移，当免疫保护水平低于播散性肿瘤细胞形成转移的能力时，就会发生复发。在B中，在不改变播散性肿瘤细胞形成转移的行为的情况下，通过增强免疫系统（绿线）延缓免疫系统的衰退，延长保护窗口以覆盖转移形成的整个生命周期，从而减少和预防复发。未增强免疫系统的衰退用蓝色虚线标出。

材料和方法

肿瘤模型和动物：在三种小鼠可移植肿瘤中，Pan02是来源于C57BL/6小鼠的小鼠胰腺肿瘤，来自NCI肿瘤保藏中心。c26是一种化学诱导的小鼠结肠肿瘤，来源于BALB小鼠。它是从ATCC获得的。MCA207是一种化学诱导的小鼠肉瘤，来源于C57BL/6小鼠。如前所述，它是从NCI外科的杨博士那里获得的[20]。所有的肿瘤系都已经过测试，没有已知的常见小鼠病原体，并且它们的使用已经得到动物研究委员会的批准。所有小鼠都是从Charles River Laboratory或Jackson Laboratories获得的。通过用新收获的肿瘤细胞或片段在体内传代，并通过在10%DMSO和90%胎牛血清中冷冻新收获的肿瘤片段或细胞来维持肿瘤系。关于动物肿瘤的建立、肿瘤监测和肿瘤大小计算、化疗、白介素-12给药、T细胞耗竭和肿瘤切除手术，请参考我们之前的研究[19-22]。

临床研究与分析

所有患者都属于一组单独咨询的病例，没有在任何临床试验中列出。患者在阅读了我们其中一个人（宗康拉）关于我们对肿瘤免疫学的观点及其在解释一些众所周知的临床问题/困惑方面的应用的在线帖子（http：//bbs.tianya.cn/post-free-3107631-1.shtml）后，前来询问我们的建议。咨询的本质是基于我们的免疫学观点，与患者或其亲属自由交换我们对他们疾病过程的解释。病理分析由位于中国北京的第三方商业服务中心 （Lawke Laboratories, http：//www.lawke.com ） 基于标准临床方案，使用患者家属提供的肿瘤样本石蜡切片进行。针对特定标志物的抗体是常见的商业抗体，已广泛用于人类癌症病理学分析。我们在回顾他们的病历后，向患者及其家庭成员提供了免费的学术建议。鼓励患者与医疗服务团队讨论建议并制定术后治疗计划。所有病人都允许我们在学术交流中使用他们的病例，比如这份手稿。

结果

测试预测1

为了测试预测1，我们选择了三种常用的免疫原性已知的肿瘤模型。小鼠Pan 02是一种自发衍生的可移植胰腺癌，可在C57BL/6小鼠中形成皮下肿瘤。非免疫原性肿瘤在皮下接种时不会诱导免疫反应。在另一个极端，小鼠MCA207是C57BL/6小鼠中的化学诱导肉瘤，其在皮下建立时诱导抗肿瘤免疫，该免疫可以防止在远处通过第二次接种施用的相同肿瘤的发展，因此被称为免疫原性肿瘤[19]。第三种肿瘤模型是小鼠C-26结肠癌，一种在BALB/c小鼠中化学诱导的肿瘤。它是一种弱免疫原性肿瘤，因为它可以在皮下建立时诱导免疫识别，但是它诱导的免疫通常是不一致的，并且不如MCA207那样强，因此它被认为是Pan02和MCA207 [21]之间的中间体。如果预测1是正确的，我们预计肿瘤免疫原性和术后复发之间存在反比关系。用来自三种肿瘤中每一种的5 x 105 个肿瘤细胞对8周龄的幼鼠进行皮下接种。接种后约10-14天，当皮下肿瘤直径为7-10毫米时，进行手术以完全切除肿瘤。手术后，观察小鼠肿瘤复发情况。结果表明，肿瘤免疫原性与术后复发之间存在明显的负相关。对于低免疫原性肿瘤Pan02，术后局部复发率高达85%（表1）。对于c26肿瘤，术后局部复发率为35%。最后，对于免疫原性肿瘤MCA207肿瘤，局部复发率仅为6%。在任何实验组中都没有观察到远处转移。因此，这三种肿瘤模型术后肿瘤复发的总体比较完全符合我们复发窗口模型中的第一个预测（图1A）。

表1：观察到的肿瘤免疫原性与术后局部肿瘤复发之间的相关性。皮下肿瘤通过肿瘤细胞接种建立。肿瘤可触及10天后，进行手术以完全切除肿瘤。将无瘤小鼠保留一个月内观察局部复发。肿瘤复发率显示为每组复发小鼠数/小鼠总数（%）。从几个实验中收集数据。

测试预测2

该试验旨在破坏术后抗肿瘤免疫，观察肿瘤复发情况。为此，我们使用了最具保护性的肿瘤模型MCA207，该模型通常表现出接近100%的术后保护作用（表1）。我们使用了两种方法来破坏术后抗肿瘤免疫。首先，我们通过CD4/CD8 T细胞抗体耗尽了T细胞。在第二种方法中，我们选择在肿瘤手术后应用化疗来抑制抗肿瘤免疫。这是一种常见的术后临床实践，用于影响肿瘤的生存能力，但也可能影响免疫功能。为此，我们使用了化疗药物5-FU。在先导研究中，我们知道连续服用这种药物4天会导致白细胞计数显著减少到骨髓抑制水平。然而，我们没有干扰T细胞功能的确凿证据。对于试验，我们用MCA207肿瘤细胞皮下接种小鼠，如表1所示的试验。手术切除已建立的皮下肿瘤两天后，将小鼠分成表2中所列的三组。一组未接受治疗，作为对照组。另一组接受CD4/CD8抗体以耗尽T细胞。最后一组接受5-FU化疗，以减少T细胞数量和功能。治疗后，留下小鼠观察复发情况。因为我们不确定在该肿瘤模型中会发生自发复发，所以我们选择在T细胞破坏治疗后的一天，在切除肿瘤的对侧皮下接种1 x 105 MCA207肿瘤细胞。在之前的先导试验中，我们知道这种接种剂量将导致幼鼠100%的肿瘤获得，但是在MCA207肿瘤切除手术后，大多数无肿瘤动物会排斥这种接种剂量。对照组的小鼠也在同一时间接受了这种接种。观察所有小鼠的原位复发（在手术部位）和接种部位的肿瘤获得（表2）。不出所料，对照组中所有仅接受手术切除肿瘤的无瘤小鼠在三个月的观察期内未出现任何局部肿瘤复发。此外，该组10只小鼠中有8只也排斥了对侧的肿瘤接种。相比之下，接受抗CD4/CD8 T细胞抗体的T细胞耗竭的10只无肿瘤小鼠中有6只在手术部位自发复发，并且对侧肿瘤接种也发展成肿瘤。对于术后接受化疗的组，10只小鼠中有3只出现手术部位肿瘤的局部复发。这3只小鼠中的每一只也在相对侧的肿瘤接种部位发生肿瘤。然而，在该组中自发的局部复发很小，并且进一步抑制生长。这可能是由于化疗后免疫功能的恢复。与对宿主无害的T细胞耗竭不同，化疗不能重复应用，因此只能维持7-10天的短暂时间来抑制T细胞。恢复的T细胞及其功能可能是该组复发肿瘤持续发展受到抑制的原因。总之，这些观察结果表明，破坏T细胞数量和功能的干预措施可能会削弱手术后的免疫保护，从而促进手术后肿瘤的复发。这直接支持第二个预测，并支持抗肿瘤免疫是对抗术后肿瘤复发的关键因素的观点。正是抗肿瘤免疫阻止了播散的肿瘤细胞形成肿瘤结节。观察到在手术部位出现自发复发的同一只小鼠也未能保护对侧的肿瘤挑战，这表明这是一种系统性效应，支持免疫力减弱作为原因，并指出如果存在这种扩散，则可能出现自发转移。在本试验中，人工肿瘤接种的使用被验证为一种测量术后防止复发的免疫保护的方法。这很重要，因为这将是下一次测试预测三的主要读数。长期以来，广泛的术后化疗可能会干扰抗肿瘤免疫对肿瘤复发的保护，这一事实一直受到怀疑，这是临床上的普遍看法，但我们在此之前并未显示。这一观察表明，广泛的术后化疗将干扰免疫对癌症复发的保护。

表2：手术后的T细胞抑制导致自发复发增加和对肿瘤攻击的免疫保护降低。小鼠皮下接种MCA207肿瘤细胞。在可触及的肿瘤（直径4-7毫米）形成10天后，对荷瘤小鼠进行手术以完全去除皮下肿瘤。手术后三天，当小鼠完全康复时，它们被分成三组，如表中所列。一组连续两天接受CD4/CD8抗体，然后每周维持抗体给药。另一组接受连续4天的5-FU化疗。第三组没有接受任何抗T细胞治疗。在最后一次化疗后的一天，所有三组小鼠在手术对面的一侧接受1 x 105  MCA207肿瘤细胞接种。一组幼鼠也接种了这种肿瘤，以确保这种剂量的肿瘤接种能够100%的获取肿瘤。观察小鼠手术部位肿瘤复发情况及接种部位肿瘤情况1个月。当触诊（2mm）超过一周时，计算复发率。复发率和肿瘤接种率以各组复发或接种肿瘤小鼠数/总小鼠数（%）表示。给出了单个实验的数据

测试预测3

免疫作为肿瘤复发的重要保护力量，提高癌症患者术后预后最重要、最实用的方法是尽可能延长免疫保护。我们基于复发窗口模型的第三个预测是关于这个的。对这一预测的测试需要一种免疫操作，这种免疫操作能提高术后对肿瘤复发的保护，比单独手术时的水平更高。为此，我们选择了一种有改善术后预后空间的中间免疫原性肿瘤模型。基于表1中的测试，弱免疫原性肿瘤C-26是这样的选择。事实上，在之前的一项研究中，我们已经展示了一个实验来证明这一点[21]。实验图和观察结果在图2中重新绘制。在该实验中，我们使用了三种方法来增强术前抗肿瘤免疫：化疗、白细胞介素-12和这两者的组合。我们以前的研究已经证明白介素-12、化疗或两者结合可增强抗肿瘤免疫[18]。术后肿瘤复发的测量是通过肿瘤再接种进行的。上面的测试表明，这种替代测量可以反映自然肿瘤复发（表2）。实验如图2A所示。小鼠首先接种皮下c26肿瘤细胞。选择该模型是因为它是一种弱免疫原性肿瘤模型，具有扩增抗肿瘤免疫和增强术后保护的空间。未选择非免疫原性肿瘤模型Pan02，因为没有任何证据表明没有预先存在抗肿瘤免疫，化疗或白介素-12可以增强抗肿瘤免疫[19]。当肿瘤达到7-10毫米时，小鼠被分成4组，并且用1） 无治疗（荷瘤）；2）单剂量环磷酰胺（Cy）化疗；3）白细胞介素-12的三次注射；4） Cy后三次注射白介素-12。治疗开始10天后，我们进行了切除肿瘤的手术。手术后10天，对无肿瘤小鼠的相对侧进行c26肿瘤细胞接种，并记录肿瘤获得和肿瘤大小以进行比较。如顶部条形图所示，将C-26肿瘤接种给初生小鼠，10只小鼠中0只产生了肿瘤排斥反应，而仅通过手术治疗的16只荷瘤小鼠中有2只产生了排斥反应，说明该肿瘤模型的免疫原性较弱。化疗对术后复发的保护作用很小，只有十分之一的小鼠排斥了再接种。但是，尽管在大多数小鼠身上都出现了肿瘤，但与接受相同再接种的小鼠相比，之前切除了C-26肿瘤的小鼠的肿瘤生长速度较慢（图2B，底部）。观察到了单独使用白介素-12或联合化疗和白介素-12治疗的组对术后抗肿瘤免疫保护的真正影响。白介素-12单独组9只小鼠中有4只（44%）和Cy+白介素-12组17只小鼠中有13只（77%）排斥了再接种。少数接受肿瘤切除的小鼠也表现出明显较慢的肿瘤生长。这些观察表明，术前抗肿瘤免疫的提高可能导致术后抗肿瘤复发免疫保护的提高，并支持我们在复发窗口模型中的第三个预测（图1）。这个实验的一个有趣的观察结果是，手术后保护作用的增强与手术切除肿瘤的T细胞浸润所显示的抗肿瘤免疫功能的增强之间明显不一致。（图2C）显示了来自每组两只小鼠的肿瘤内免疫浸润（CD 3 T细胞）。很明显，T细胞最显著的增加与Cy+IL-12治疗一致。这种T细胞浸润的增加已经在我们以前的研究中描述过了[18，20]。另一方面，除IL-12单独治疗组外，其他组中T细胞浸润的缺乏与术后保护的缺乏有关，化疗组的两个肿瘤中有一个肿瘤（肿瘤2）显示T细胞浸润的增加是来自该组中排斥肿瘤再接种的单只小鼠。令人惊讶的是，IL-12治疗组的两个肿瘤均未显示出T细胞浸润增高，而两个肿瘤均来自排斥肿瘤再接种的小鼠。这一观察结果，虽然具有传闻性质，但表明T细胞浸润的明显增加很可能与术后免疫保护对肿瘤复发有更好的关系，而在某些治疗条件下（如IL-12），缺乏T细胞浸润并不意味着缺乏术后免疫保护。然而，这一分析为我们提供了一种评估手术样本抗肿瘤免疫的实用方法，以准确评估术后免疫保护，从而评估癌症患者肿瘤复发的可能性（见下文）。

图2：术前抗肿瘤免疫的提高导致术后针对肿瘤复发的免疫保护增强。实验步骤流程如图所示。小鼠接种了C-26肿瘤细胞，并在14天内肿瘤可触及时分成组。对每组小鼠进行所列的治疗，并在第24天对小鼠进行手术以完全去除所有肿瘤。手术后10天，每组无瘤小鼠和一组幼稚小鼠在手术的对侧接受1 x 105 C-26细胞的再接种。将小鼠留作观察。对抗再接种的保护率显示为每组中肿瘤进展的小鼠数量相对于总小鼠数量的比率。再接种后18天，各组肿瘤的平均大小显示为长×宽的面积（单位为毫米）（图B，柱状图）。***和****：与单纯手术（bearing）组相比，统计学意义分别为p<0.01和p<0.001。图C显示了来自每组两个选定肿瘤的冷冻切片通过免疫组化来显示肿瘤内T细胞浸润的例子。文本中描述了选定小鼠的身份。T细胞是红色的。显微照片放大倍数为40X

临床相关自然肿瘤复发模型

图3：在小鼠肿瘤模型中，术前抗肿瘤免疫的提高导致自然肿瘤复发的延迟和减少。新生小鼠皮下接种MCA207细胞。肿瘤接种后20天，当大多数肿瘤直径达到11-14毫米时，小鼠被分成4组，如图所示。每组小鼠的数量从20-32只不等。从指定治疗开始后7-10天，对患有肿瘤的小鼠进行手术以完全去除肿瘤。将小鼠留作观察，直到复发（无复发生存率下降）或非事件死亡（用垂直线标记）。数据显示为无疾病生存的卡普兰迈耶曲线。一组相同年龄的幼稚小鼠在整个观察期内一直饲养到全部自然死亡（蓝线，100%无病存活）。时间线表示手术后的观察期，以天为单位。计算单独手术和其他组之间的统计比较，并且与白介素-12+手术和Cy+白介素-12+手术相关的显著性差异。图表中给出了这两组的p值

尽管所有上述实验都支持我们的术后肿瘤复发模型，这些实验证明了这一原理，但我们希望有一个更具临床相关性的实验，癌症患者术后肿瘤复发的最大挑战是发生在癌症手术后1-3年的所谓延迟复发。在这些情况下，手术本身显然是完整的，没有局部复发，因此肿瘤被完全切除。主要问题是抗肿瘤免疫的衰退，前提是在诊断和手术之前无法改变个体播散肿瘤细胞的生物学行为。有没有可能通过增强免疫力来扩大术后保护（图1B）。上述试验表明，在肿瘤抗原供应存在且可用的情况下，这可以通过术前操作来完成。在小鼠肿瘤模型中的上述测试使用肿瘤再接种来模拟复发和转移，而在癌症患者中，这是手术后需要很长时间的自然过程。小鼠肿瘤模型中的类似过程以前从未有过报道。为此，我们选择了MCA 207肿瘤模型进行实验，因为它是一种免疫原性肿瘤，只有免疫原性肿瘤不能在术后快速局部复发（表1），因此可能在宿主免疫减弱后复发（表2）。此外，自然复发是以局部肿瘤还是向远处转移的系统性肿瘤的形式出现还不清楚。因此，进行该实验的意图是在手术前提高抗肿瘤免疫，以观察这种提高的抗肿瘤免疫是否能转化为增强的手术后保护，防止自然局部或全身复发。为此，我们包括以下四个对照组：1）单纯手术；2）化疗（Cy），然后手术；3）白细胞介素12随后进行手术；4）Cy+白细胞介素-12，然后手术。为了避免在手术前通过这些治疗完全消退肿瘤，我们在治疗开始时使用了带有10-13毫米大肿瘤的小鼠。预计这将是一项涵盖整个小鼠寿命的长期实验，我们还包括一组幼稚小鼠，观察其缺乏自然肿瘤发育，以表明实验组中出现的任何肿瘤都来自MCA207接种。为了确保数据的统计意义，我们在实验开始时每组至少包括20只小鼠，在IL-12+手术组至少包括30只。所有术后短期复发（6个月内）的小鼠均不被视为延迟复发，并被排除在最终分析之外。本实验无病生存的卡卡普兰迈耶曲线分析如图3所示。首先，自然复发确实发生在所有组中，尽管延迟了大约两年（白细胞介素-12+手术组除外）。由于小鼠寿命有限，复发发生在手术后两年，接近自然寿命的终点。因此，我们没有时间观察单独手术组的更多或所有小鼠是否会自然复发。事实上，没有一只相同年龄的幼稚对照小鼠发生肿瘤，这表明实验组中的所有肿瘤都来自MCA207接种。其次，复发大多不是在手术部位观察到的，而是在远处的部位观察到的，并且通常是在腹膜腔（未示出）。由于一些转移是在手术部位的相反侧发现的，并且在骨骼和肌肉中（例如在肩部区域），转移不是由手术过程引起的，而是由肉瘤肿瘤细胞通过原发肿瘤的循环正常和自然地扩散引起的。考虑到该肿瘤中的自发抗肿瘤免疫通常是在肿瘤接种后一周建立的，并且假设一旦免疫到位就进行免疫监视以抑制肿瘤扩散，这种在如此强免疫原性肿瘤模型中的真正转移灶的存在表明癌症即使在最严格的环境下是致命的。这种延迟复发是首次报道的小鼠免疫原性肿瘤模型，它支持小鼠肿瘤模型与人类癌症复发的完全相关性。这表明，使用小鼠模型开发的任何操作可能对癌症患者同样有效。第三，在术前抗肿瘤免疫增强最强的组（即白介素-12和Cy+白介素-12组）中，复发显著或几乎显著延迟，这支持了复发延迟是抗肿瘤免疫衰退的结果的解释。我们以前的研究已经表明，在这种肿瘤模型中，这些操作在激活和增强抗肿瘤免疫方面非常有效 [18]。另一方面，在Cy+白细胞介素-12组中出现两次复发是相当令人震惊和出乎意料的，因为Cy+白细胞介素-12是已知最强的提高抗肿瘤免疫的方法，因为它无需手术就能消除非常大的肿瘤负担，而且我们还观察到在明显治愈的小鼠中终身无复发存活[18]。用Cy+IL-12治疗的小鼠术后复发的观察结果表明，与未经手术的Cy+IL-12免疫增强肿瘤抗原的自然清除相比，手术应激可能干扰了终身免疫记忆的发展[18]。然而，与所有其他组相比，用Cy+白介素-12治疗的小鼠组显示出最佳的术后预防复发保护。虽然用Cy+白细胞介素-12治疗的小鼠在手术前确实有一些显著的肿瘤消退，但未观察到手术后保护与肿瘤反应和通过手术前治疗减轻肿瘤负担之间的关联。正如我们在之前所展示的那样，Cy治疗组中的老鼠也是如此。但是单独使用白细胞介素-12而不进行化疗不会导致肿瘤消退，一些小鼠在手术时确实有超过15毫米的大肿瘤。正是由于患有大肿瘤的小鼠手术不完全的几率增加，我们将30多只小鼠纳入了这个组。尽管这一组中的大多数小鼠的肿瘤比所有其他组大得多，但实际完成手术的比率比预期的要高。因此，该组与仅接受手术而未接受手术前治疗的组在手术后保护方面几乎有显著差异，这将反对将手术中的肿瘤负担作为更好的手术后保护的一个因素。总之，该实验的结果表明，在免疫原性小鼠肿瘤模型中，手术切除原发肿瘤后的自然肿瘤复发和转移在抗肿瘤免疫通常衰退的长时间延迟后仍会发生。手术前提高免疫力将有助于进一步延迟和减少复发。因此，在完成这四项研究后，我们提供了证据表明，我们提出的术后肿瘤复发窗口模型如图1所示是准确的。

术后肿瘤复发窗口模型在肿瘤管理中的应用

如果抗肿瘤免疫对于术后预防肿瘤复发至关重要，正如我们的动物实验所表明的，那么只要我们能够准确评估特定患者在癌症手术后抗肿瘤免疫的真实状态，抗肿瘤免疫就应该直接应用于癌症管理。为此，我们检查了癌症手术的一些手术样本，并试图将我们的动物模型观察与术后预后和结果联系起来。我们三年前就已经开始这样做了，最初在规模和经验上是初步的，最近逐渐变得更加自信和准确。这些临床分析将在另一份手稿中发表。在这里，我们描述了使用手术样本评估癌症患者抗肿瘤免疫状态的基本原理和实践。我们的推理如下：1）作为免疫应答的抗肿瘤免疫由T细胞进行，并集中在抗原（肿瘤）部位。因此，检查肿瘤样品中是否存在T细胞是评估抗肿瘤免疫的合适方法。2）不仅T细胞的数量至关重要，T细胞的功能也很重要。T细胞的抗肿瘤作用可以通过两个重要方面来体现：抑制肿瘤复制和破坏肿瘤结构和细胞。3）肿瘤内部的抗肿瘤免疫也通过与肿瘤复制和侵袭相关的T细胞分布来反映。它就像一张“战争地图”，通常不是均匀地分布在整个肿瘤中，而是不均匀地分布，因此对一小部分肿瘤进行采样可能无法反映这种分布及其背后的关键信息。这一点反映在我们之前用小鼠肿瘤进行的研究中[23]。因此，使用手术样本评估抗肿瘤免疫比使用小活检样本更有价值。在任何基因检测中，T细胞分布信息也同样会丢失。4）测试细胞亚型如CD4和CD8以及T细胞的激活状态是需要评估的关键因素，因为激活的T细胞总是与更强和更持久的抗肿瘤活性相关联。基于这些原因，我们选择用HE、Ki-67、CD3和CD8进行免疫组化来检查原发灶的石蜡切片。肿瘤结构通过HE染色来确定，并且通过这种染色可以容易地看到所定义的肿瘤结构的任何破坏（见下面的实施例）。肿瘤活性（复制和代谢活性）由Ki-67（或PCNA）染色确定。阳性染色揭示了两条关于肿瘤细胞的关键信息。一个是复制中肿瘤细胞的数量（增殖指数），另一个是复制细胞的代谢活性。这是通过观察单个复制细胞的染色强度。一个代谢活跃的细胞呈现强烈的Ki-67染色和增大的细胞核。然后通过用CD3（总T细胞）和CD8染色T细胞来揭示抗肿瘤免疫的状态。由于总的T细胞主要由CD4和CD8单一阳性细胞组成，CD4和CD8之间的比率可以从这些染色中容易地推断出来。肿瘤活性、亚型、激活状态（放大的圆形的细胞膜着色被认为代表激活的T细胞）和抗肿瘤功能的存在、分布和关系都可以通过观察与其他染色相结合的T细胞染色来容易地揭示。下面给出的一些例子很好地说明了这一点（图4-7）。例如，在一个极端的情况下，高等级胶质母细胞瘤是所有实体瘤中最致命的癌症，无论术后用化疗和放疗进行治疗，其术后复发率都超过90%。对大多数胶质母细胞瘤病例的外科肿瘤样本的分析显示，几乎完全缺乏抗肿瘤免疫，如图4所示。但是偶尔，也可以看到抗肿瘤免疫的存在（图5）。在这些病例中，尽管发现T细胞反应的规模有限（如图5B-F所示的数量和分布），但术后复发明显延迟（例如，在这个病例中超过两年没有广泛的术后辅助放射治疗）。存在或不存在抗肿瘤免疫的胶质母细胞瘤患者术后预后的强烈对比，强调了抗肿瘤免疫在决定术后肿瘤复发命运中的重要作用。在另一个极端，大多数意外发现的肺癌是一期，通过手术可以治愈。对手术样本的检查揭示了两种典型情况。在存在恶性肿瘤细胞（例如Ki-67阳性肿瘤细胞）的情况下，肿瘤内总是共存大量免疫细胞（通常为CD8），通常几乎完全抑制肿瘤复制（图6）。在没有明显存在T细胞（抗肿瘤免疫）的情况下，肿瘤不是恶性的（没有任何Ki-67染色细胞）和非侵袭性的（我们未发表的观察结果）。在这两个极端之间是其他的癌症病例，一些具有很强的抗肿瘤免疫，因此具有较好的术后预后，而另一些具有较差的抗肿瘤免疫，由于肿瘤复发而具有较差的预后。一项重要的任务是为个体化病例的术后预后建立可靠的评估指南。因此，如果可以评估T细胞的存在和数量，如果可以评估它们的功能并确定它们的激活状态，我们相信我们可以对给定患者的抗肿瘤免疫反应状态进行可靠的评估。完成这一评估后，结合肿瘤生物学（肿瘤恶性程度）、临床病史（癌症分期和治疗反应），我们通常可以对手术后的预后做出个体化的预测，并与随后的临床过程有效相关（我们未发表的结果）。例如，图7是胆管癌的非典型病例。大多数胆管癌患者伴随免疫功能差，预后差（我们未发表的观察结果）。即使在切除原发灶的情况下，术后肝转移也很常见。然而，在这个病例中，抗肿瘤免疫的存在是非常明显的，因为在仅有的活性残余肿瘤周围有很大的区域充满了免疫细胞和炎性细胞。在肿瘤核心看到的典型胆管癌结构被完全破坏，没有残留的肿瘤细胞存活或复制。在这种情况下，破坏肿瘤结构和抑制肿瘤复制这两种免疫功能都从病理分析中得到证实。否则，简单的基于HE染色分析可能会将这种严重的免疫浸润与肿瘤低分化混淆（该病例的病理报告有这种准确的描述）。结合病史，我们了解到这是一个在常规体检和检查中意外发现肿瘤的病例，其中可见CA19-9肿瘤标志物升高。在我们看来，根据观察到的强免疫力，如果患者没有检测到这个肿瘤，它可能已经通过抗肿瘤免疫自行完全消退。随着手术切除，应保留强大的抗肿瘤免疫，以长期保护任何肿瘤复发（如果不能达到临床治愈）。基于这一评估，该患者仅接受观察，没有额外的治疗，并且已超过三年无复发。

图4：一例IV级胶质母细胞瘤手术样本切片的显微视图（40x），用HE、Ki-67和CD3染色，显示存在活跃的肿瘤复制，而缺乏T细胞和抗肿瘤免疫。

图6：意外发现的早期肺癌的典型病例。该病例手术样本的切片按标记染色，切片显微照片（40x）

讨论

在这项研究中，我们提供了动物肿瘤模型的支持证据，支持术后肿瘤复发的窗口模型 （图1）。我们的数据完全支持这一假设，并表明抗肿瘤免疫是术后肿瘤复发的主要决定因素。这是基于肿瘤在手术前扩散的前提条件。这与临床相关，因为大多数接受手术的癌症患者都符合这些条件。尽管长期以来一直怀疑、观察到共存的抗肿瘤免疫的作用，并提出了其抗肿瘤潜力，但尚未根据其原则[2、8、6]对患者进行治疗。外科医生不会根据抗肿瘤免疫的状态及其术后保护的潜力进行手术。根据不包括抗肿瘤免疫状态的临床分期，患者仍需接受术后辅助治疗。对其原则缺乏临床适应性的解释是不相信其重要性。医生们并不热衷于将它用于日常癌症管理。尽管大量已发表的研究显示了通过T细胞浸润到肿瘤中显示的抗肿瘤免疫的预后重要性，但在决定后续治疗时，术后管理并未考虑这一标准 [11-17]。我们认为，缺乏一个临床相关的临床前肿瘤模型来证明抗肿瘤免疫在术后肿瘤复发中的临床意义，是临床医生长期忽视的主要原因，另一个原因是缺乏准确评估抗肿瘤免疫的方法，本研究在小鼠肿瘤模型中的目的是解决这两个问题，动物肿瘤模型研究和肿瘤患者手术标本T细胞浸润的发现似乎解决了这些问题。

图1中的术后肿瘤复发模型解释了当前在切除原发灶后对癌症患者肿瘤复发和转移的观察。它假设肿瘤扩散已经在手术时发生，并且手术仅消除了新肿瘤扩散的来源。在肿瘤完全手术切除的情况下，复发的形式是新建立的转移，而不是残余未切除肿瘤的复发。在这种情况下，转移的建立遵循图1中描绘的曲线，基于这样的假设，即任何具有形成个体转移能力的播散肿瘤细胞在微环境允许的情况下尽早形成个体转移。一个播散的肿瘤细胞形成转移的能力由该细胞的生物学特性决定，主要是自驱动的肿瘤复制。但是不管它是否能形成，转移是癌细胞与其环境之间的相互作用，主要是通过抗肿瘤免疫来消除。对于给定的肿瘤，生物的所有播散癌细胞的特征是固定的，术后环境条件是恒定的。因此，转移建立的速率应该如图1所示衰减，直到能够形成转移的所有播散肿瘤细胞耗尽。这就是为什么经过4-5年的无病生存后，该病例被认为是“临床治愈”。因此，手术后最危险的一个“窗口”时期，是肿瘤转移仍然可以建立，但抗肿瘤免疫已经衰退到不能识别和消除已形成的转移的程度。基于这一模型，我们提出的改善术后预后的方法是延长免疫保护期（或任何这方面的保护）。在这方面，我们的动物研究清楚地表明这是一种切实有效的方法。这应该很容易应用于临床环境和新辅助化疗，之前已经证明新辅助化疗会影响术后无疾病生存[23-28]。正如我们在以前的许多研究中所证明的那样，白细胞介素-12的使用通过提高抗肿瘤T细胞的数量和质量，有助于进一步增强活化的免疫[18-22]。白介素-12以前已经在临床试验中进行过研究。早期大量给药的研究显示了严重的毒性，但随后减少给药和给药的研究证明了其安全性[29]。我们认为需要确定的是这一药物的使用时机，因为我们已经表明，T细胞活化是其有效性的先决条件[19]。化疗能够激活已有的抗肿瘤免疫的事实为白介素-12 [22]创造了潜在的作用条件。在临床环境中，需要确定的是个体患者在任何给定时间（例如化疗前后）的免疫状态。目前还没有既定的测试来衡量这一点，但肯定有必要尽快开发一个。需要指出的是，即使在我们的实验中，像Cy+白细胞介素-12这样的术前抗肿瘤免疫能力最强的情况下，仍然存在肿瘤复发，尽管复发率大大降低，且时间延迟（图3）。可能的原因是免疫记忆的质量。对于不同的抗原，对于不同的反应，抗原清除后形成的免疫记忆可能差异很大。这种想法显然得到了各种人类疾病疫苗临床活动的支持，有些疫苗可以持续终生，有些疫苗只能持续几年。我们预计这种针对个体肿瘤的记忆变化也发生在癌症患者身上。因此，仅提高术前抗肿瘤免疫可能无法完全解决复发问题。在最佳免疫识别条件下，肿瘤抗原的间歇供应应被视为提高免疫力的可能策略。这是使用手术肿瘤组织制备肿瘤疫苗的科学基础。根据我们的窗口模型，疫苗给药的时间应该在免疫下降到保护水平以下之前，而不是在手术后不久有足够的免疫保护时。许多以前的肿瘤疫苗研究都没有考虑这个时间因素。由于手术材料有限，应根据个体患者的免疫状况谨慎选择时间。

本研究中呈现的人类肿瘤的病理分析与先前对T细胞浸润的分析有根本的不同。首先，我们的分析不仅仅集中在T细胞上，而是全面的，它集中在T细胞和肿瘤之间的关系上。我们的策略试图回答以下问题。1）是否存在T细胞？2）在复制和结构方面，T细胞的存在是否干扰肿瘤生长？3）从免疫角度来看，T细胞浸润是否符合病史？例如，T细胞的存在是否解释了观察到的转移瘤的缺乏？它能解释没有症状的病史吗？这与以前所有只考虑肿瘤浸润性T细胞的数量和类型，而不考虑这些细胞的功能或分布的研究大不相同。许多先前的研究使用了从肿瘤蜡块中钻取的小样本检查，希望能计算出肿瘤内的T细胞数量。这些研究可能无法确定一幅真实的T细胞分布图，因为在一个大肿瘤中通常存在不均匀的分布。相比之下，我们的分析为T细胞如何攻击肿瘤提供了更真实的图像。例如，我们经常看到T细胞在肿瘤侵犯的另一侧聚集。另一些时候，我们看到T细胞在一个区域内围绕着小肿瘤团形成一个“分离和破坏”的结构。免疫的抗肿瘤功能仅通过大面积肿瘤切片的观察可见，肿瘤复制和T细胞的分布同时存在。T细胞的存在和肿瘤复制的减少之间的明显“拮抗”强烈暗示了T细胞可能抑制肿瘤复制。类似地，在存在大量T细胞的区域，我们经常看到肿瘤结构被破坏并形成一个实体区域。许多病理学报告将这种区域描述为 “低分化肿瘤”，但事实上，这是免疫攻击的结果，与肿瘤分化无关。区分这两种可能性的可靠方法是同时观察肿瘤复制活动。正是先前分析和我们的综合分析之间的这些基本差异，使得先前分析仅具有显著的组内统计数据，而对单个患者术后预后的准确预测没有帮助。通过我们在这里和随后的手稿中描述的分析，我们相信可以建立一个评估个体患者免疫状态的可靠指南。我们旨在前瞻性地研究此假设，以识别具有免疫细胞识别能力的肿瘤患者，并通过IL-12 +/-化疗增强和扩大共存的抗肿瘤免疫力，以确定我们是否可以产生有效的抗肿瘤反应，从而更好地转化为术后预后。我们在小鼠中的数据表明，了解免疫细胞识别、激活和扩增抗肿瘤免疫将改善癌症患者的预后。

结论

癌症外科治疗的最大挑战是术后肿瘤复发和转移。在这项研究之前，还没有明确的解释为什么癌症复发发生在一些病人身上，而不是其他人身上。这项研究首次提供了一个可能的解释，并在动物肿瘤模型中研究了这一假设。这项研究有两个中心发现。第一，对于癌症的外科治疗，长期结果中最关键的因素是术后抗肿瘤免疫水平。第二，术前增强抗肿瘤免疫将对术后预防肿瘤复发产生直接影响。为了将这些发现应用于癌症护理，本研究还展示了如何在手术前提高抗肿瘤免疫，如何评估手术样本的抗肿瘤免疫状态并做出预后预测。这些是对我们目前癌症管理知识的重要补充，如果成功应用于临床实践，将共同改变癌症战争的格局。

参考 

1. MacKie RM, Reid R, Junor B (2003) Fatal melanoma transferred in a donated kidney 16 years after melanoma surgery. N Engl J Med 348: 567-568. 

2. Dunphy JE (1950) Some observations on the natural behavior of cancer in man. N Engl J Med 242: 167-172. 

3. Rhim AD, Mirek ET, Aiello NM, Maitra A, Bailey JM, et al. (2012) EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell 148: 349-361. 

4. Kang Y, Pantel K (2013) Tumor cell dissemination: emerging biological insights from animal models and cancer patients. Cancer Cell 23: 573-581. 

5. Janni W, Rjosk D, Braun S (2000) Clinical relevance of occult metastatic cells in the bone marrow of patients with different stages of breast cancer. Clin Breast Cancer 1: 217-225. 

6. Joosse SA, Gorges TM, Pantel K (2015) Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Mol Med 7: 1-11. 

7. Hinz S, Bockhorst J, Roder C, Egberts JH, Schafmayer C, et al. (2012) Disseminated tumor cells in the bone marrow negatively influence survival after resection of colorectal liver metastases. Ann Surg Oncol 19: 2539-2546. 

8. Prehn RT, Main JM (1957) Immunity to methylcholanthrene- induced sarcomas. J Natl Cancer Inst 18: 769-778. 

9. Gershon RK, Carter RL, Kondo K (1968) Immunologic defenses against metastases: impairment by excision of an allotransplanted lymphoma. Science 159: 646-648. 

10. Deckers PJ, Edgerton BW, Thomas BS, Pilch YH (1971) The adoptive transfer of concomitant immunity to murine tumor isografts with spleen cells from tumor-bearing animals. Cancer Res 31: 734-742. 

11. Hakansson L, Adell G, Boeryd B, Sjogren F, Sjodahl R (1997) Infiltration of mononuclear inflammatory cells into primary colorectal carcinomas: an immunohistological analysis. Br J Cancer 75: 374-380. 

12. Ropponen KM, Eskelinen MJ, Lipponen PK, Alhava E, Kosma VM (1997) Prognostic value of tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) in colorectal cancer. J Pathol 182: 318-324. 

13. ZhangL,Conejo-GarciaJR,KatsarosD,GimottyPA,Massobrio M, et al. (2003) Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 348: 203-213. 

14. KhanH,PillarisettyVG,KatzSC(2014)Theprognosticvalue of liver tumor T cell infiltrates. J Surg Res 191: 189-195. 

15. Lee HE, Chae SW, Lee YJ, Kim MA, Lee HS, et al. (2008) Prognostic implications of type and density of tumour-infiltrating lymphocytes in gastric cancer. Br J Cancer 99: 1704-1711. 

16. Tewari N, Zaitoun AM, Arora A, Madhusudan S, Ilyas M, et al. (2013) The presence of tumour-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays. BMC Cancer 13: 436. 

17. Ibrahim EM, Al-Foheidi ME, Al-Mansour MM, Kazkaz GA (2014) The prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in triple-negative breast cancer: a meta-analysis. Breast Cancer Res Treat 148: 467-476. 

18. TsungK,MekoJB,TsungYL,PeplinskiGR,NortonJA(1998) Immune response against large tumors eradicated by treatment with cyclophosphamide and IL-12. J Immunol 160: 1369-1377. 

19. LeHN,LeeNC,TsungK,NortonJA(2001)Pre-existingtumor- sensitized T cells are essential for eradication of established tumors by IL-12 and cyclophosphamide plus IL-12. J Immunol 167: 6765-6772.

20. Tsung K, Meko JB, Peplinski GR, Tsung YL, Norton JA (1997) IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response. J Immunol 158: 3359-3365.

21. Zhang L, Feng D, Hu Y, Tsung K, Norton JA (2015) IL-12 Augments Antitumor Responses to Cycled Chemotherapy. J Immunother 38: 137-144.

22. Zhang L, Feng D, Yu LX, Tsung K, Norton JA (2013) Preexisting antitumor immunity augments the antitumor effects of chemotherapy. Cancer Immunol Immunother 62: 1061-1071. 

23. Tsung K, Dolan JP, Tsung YL, Norton JA (2002) Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced T cell-dependent tumor rejection. Cancer Res 62: 5069-5075.

24. Melcher AA, Mort D, Maughan TS (1996) Epirubicin, cisplatin and continuous infusion 5-fluorouracil (ECF) as neoadjuvant chemotherapy in gastro-oesophageal cancer. Br J Cancer 74: 1651-1654. 

25. Trimble EL, Ungerleider RS, Abrams JA, Kaplan RS, Feigal EG, et al. (1993) Neoadjuvant therapy in cancer treatment. Cancer 72: 3515-3524. 

26. Yokomise H, Liu D, Ishikawa S, Go T, Gotoh M, et al. (2013) Chemotherapy followed by surgery on the basis of biomarker examination for patients with advanced non-small cell lung cancer. Anticancer Res 33: 5597-5602. 

27. Katz MH, Wang H, Fleming JB, Sun CC, Hwang RF, et al. (2009) Long-term survival after multidisciplinary management of resected pancreatic adenocarcinoma. Ann Surg Oncol 16: 836-847. 

28. Artinyan A, Anaya DA, McKenzie S, Ellenhorn JD, Kim J (2011) Neoadjuvant therapy is associated with improved survival in resectable pancreatic adenocarcinoma. Cancer 117: 2044-2049. 

29. Leonard JP, Sherman ML, Fisher GL, Buchanan LJ, Larsen G, et al. (1997) Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood 90: 2541-2548.